Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к инсулину человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом. Цель изобретения -получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных антител к новой детерминанте на молекуле инсулина человека. Штамм D4B3 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мыши BALB/c с клетками миеломы Р3-Х63-Ад8.653. Штамм D4B8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 440 Д. Клетки штамма D4B8 растут на среде RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом D4B8, составляет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцитной жидкости 20 мг/мл. Антигенная детерминанта для антител D4B8 включает остаток А4 А-цепи и является конформационной.^fcrf^

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4810182/13 (22) 03.04.90 (46) 07.02.92, Бюл. 3Ф 5 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Ю.В.Ионов и В.Л.Юрин (53) 578.085.23 (088.8) (56) Comlttl et aL 3 lmmunol. Methods, ч. 99, (2), 1987, р. 25. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИНСУЛИНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом. Цель изобретения—

Изобретение относится . к биотехнологии и касается получения моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом, Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши

Mus musculus, используемого для получения моноклональных антител к новой детерминанте на молекул инсулина человека, что дает возможность разработать двусайтовый иммунометрический способ определения концентрации инсулина.

Отличие моноклонального антитела, получаемого с помощью предлагаемого штамма, от известных состоит в том, что антигенная детерминанта, против которой он получен, включает остаток А4 на А-цепи,, Ы,, 1710577 А1 получение штамма гибридомы — продуцента моноклональных антител к новой детерминанте на молекуле инсулина человека.

Штамм D4B3 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мыши BALB/с с клетками миеломы РЗ-Х63-Ag8.653. Штамм

D4B8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН

СССР под номером ВСКК(П) 440 Д, Клетки штамма D4B8 растут на среде RPMJ 1640 или DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом D4B8, составляет в культуральной жидкости 50 мкгlмл, в асцитной жидкости 20 мг/мл. Антигеяная детерминанта для антител D4B8 включает остаток А4 А-цепи и является конформацион ной.

° еЪ молекулы инсулина и является конформационной, т,е. антитело не связывается с отдельными цепями, В литературе не найдено С) данных о получении антител к антигенной Ql детерминанте, включающей остаток А4 на

А-цепи и являющейся конформационной.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALE/с иммуниэируют у инсулином человека.(получен от НПО "Фермент") в полном адъюванте Фройнда в подушечки заданных лапок (по 50 мкг на мышь).

Чистота инсулина проверялась электрофоретически и составляет 98%. На 13-й день мышей иммунизируюТ в подушечки задних лапок тем же количеством инсулина в неполном адъюванте Фройнда. На 16-й день мышей забивают, достают подколенные

1710577 лимфоузлы и клетки лимфоузлов сливают с клетками миеломы Р 3, Х63, Ag8.653 с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ 2000 (Merck). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассеивают в лунки 96-ячеечного планшета (Nunc) в количестве 100 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высеваут перитонеальные макрофати мыши по 500 клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ГАТ (RPMJ 1640, содержащий гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Отбор растущих культур клеток, секретирующих антитела нужной специфичности, проводят с помощью радиоиммунологического анализа: в лунки полихлорвинилового планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, вносят культуральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, лунки промывают и инкубируют с 1 меи ченым инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма-счетчике. Гибридому, секретирующую антитела к инсулину, дважды клонировали методом лимитирующих разведений, То есть клетки рассеивают в лунках 96-ячеечных планшеток из расчета 1 клетка на лунку в ростовой среде (R P M J

1640 с 10% эмбриональной телячьей cblaoротки, 4 мм L-глютамина, 1 пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 2 мкг/мл пенициллина и 25 мкгlмл стрептомицина).

Выросшие клоны тестируют на секрецию антител. Доля клонов, сохраняющих продукцию антител заданной специфичности, составляет 100%. Штамм обозначает D488.

Штамм D4B8 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии

АН СССР под номером ВСКК (П) 440 Д и характеризуется следующими признаками, Культуральные свойства.

Среда для культивирования — RPMJ

1640 или DMEM с 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мм L-глютамина, 1 пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и

29 мкг/мл стрептомицина, Клетки культивируют при 37 С в атмосфере, содержащей

5 (СОг. Для выращивания штаммов можно использовать стеклянную и пластиковую культуральную посуду. Характер роста— стационарная суспензия.

Частота пассирования 2-3 сут. Кратность рассева 1:3-1:4. При введении мышам

BALB/с, предварительно обработанным пристаном, по 1 млн. клеток, асцит образуется через 10-15 дней. Стабильная продукция наблюдается в течение 7 пассажей на мышах, Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:128 а в асцитической

1:100000.

Продуктивность.

Концентрация антител, продуцируемых

5 штаммом D488, составляет в культуральной жидкости 50 мкг/мл, в асцитной жидкости

20 мгlмл, Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 м пассажей на живо10 тных, если гибридома перевивается.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение

15 микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновом промечивании культуральной среды.

Консервация клеток.

Клетки штаммов замораживают после 2

20 и 3-ro клонирования на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах. Криозащитная среда 50 ростовой среды, 40 эмбриональной телячьей сыворотки и 10 диметилсульфокси25 да.

Режим замораживания; клетки в криозащитной среде помещают на сутки в холодильник при -70 С, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток после

30 размораживания составляет 50, Полезный продукт.

Моноклональные антитела IgG 1 класса, Специфичность - инсулин человека, проинсулин человека. Метод оценки сохранения

35 специфичности; кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши сорбируют на поверхности лунок гибкого планшета, в лунки вносят супернатанты клеток D4B8, затем планшет отмывают и в лунки вносят 125

40 1-инсулин, планшет вновь отмывают, лунки вырезают и просчитывают в гамма-счетчике.

Пример 1. Получение антител D4B8 с помощью штамма гибридом D4B8.

45 Для получения моноклональных антител D4B8 клетки штамма гибридом D4BS выращивают в. пластиковых флаконах на среде для культивирования: RPMJ 1640 (или

DMEM) с 10 эмбриональной телячьей сы50 воратки, 4 мМ L-глютамина, 1 пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Концентрация клеток в сре . де не должна превышать 0,5 млн./мл. Когда число клеток достигнет 20 млн, клетки вво55 дят внутрибрюшинно в мышей, которым эа

10 — 14 дней ввели по 0,5 мл пристана. Для этого перед введением клеток в мышей культуральную жидкость, содержащую клетки штамма, центрифугируют 10 мин при

2000g, надосадочную культуральную жид1710577

Составитель А.Маныкин

Редактор С.Патрушева Техред М.Моргентал Корректор М.Пожо

Заказ 312 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 кость удаляют, клетки штамма переводят в среду без 10ф» эмбриональной телячьей сыворотки и вкалывают внутрибрюшинно по 1 млн, клеток на мышь. Через 10-14 дней, когда у мышей вырастет асцит, мышей за- 5 бивают и с помощью шприца забирают асцитную жидкость. Асцитную жидкость центрифугируют при 2000g в течение 10 мин, чтобы освободиться от клеток, и надосадочную жидкость используют для выде- 10 пения моноклональных антител, К асцитной жидкости мыши, содержащей монокпойальные антитела D4BS, до-. бавляют равный объем насыщенного сульфата аммония и центрифугируют при 15

5000g 10 мин. Осадок растворяют, тщательно диализуют против 0,5 М фосфатного буфера рН 7,2 и наносят на колонку с ОЕАЕ.-52. целлюлозой, уравновешенную этим жа буфером. Моноклональные антитела выходят, 20 не задерживаясь на колонке. Из 1 мл асцитной жидкости получается 18,5 мг моноклональных антител D4B8.

Концентрацию антител в асцитной и культуральной жидкостях штамма D4B8 on-. 25 ределяют с помощью иммуноферментного анализа. 100 мкл раствора инсулина в концентрации 10 мкг/мп в 0,2 M боратном.буфере вносят в лунки 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа и инкуби- 30 руют 2 ч при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки промывают 3 раза. водопроводной водой. Готовят серию пятикратных разведений исследуемых проб в 0,2 М буферном растворе рН 8,0, содержа- 35 щем исследуемых проб в 0,2 M буферном растворе рН 8,0; содержащем 0,17 желатины. Анализируемые пробы в объеме 50 мкл вносят с 2-кратным повтором в лунки планшета, покрытого инсулином и контрольным 40 белком (БСА) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После инкубации содержимое лунок удаляют, лунки промывают и в каждую вносят по 50 мкл раствора конъюгата кроличьих антител с пероксидазой хрена к иммуноглобулинам мыши, предварительно разведенного буферным раствором в

1000 раз. Планшеты инкубируют еще 2 ч, отмывают. и в лунки вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора, содержащего о-фенилендиамин (4 мг/мл) и 0,0003;,ь перекись водорода. Планшеты инкубируют

15 — 20 мин и в лунки вносят по 50 мкл 2,5 М серной кислоты для остановки реакции.

Планшеты сканируют на ридере для микропланшетов при длине волны 492.нм. Концентрацию антител в анализируемых образцах определяют по калибровочной кривой, которую получают одновременно с проведением теста. Для построения калибровочной кривой процедуру проводят так же, но вместо анализируемых образцов в лунки вносят разведения стандартных препаратов очищенных антител D4BS в известной концентрации. Концентрация антител

D4B8 в культуральной жидкости штамма

D4B8 равна 50 мкг/мл, в асцитной жидкости

20 мг/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм позволяет получить моноклональные антитела к инсулину человека; распознающие новую детерминанту на молекуле инсулина, что расширяет возможности разработки двусайтового способа определения концентрации инсулина., Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. ВСКК (П) 440

D-продуцент моноклональных антител к инсулину человека.