Способ получения твердофазного носителя для иммунохимического анализа

 

Изобретение относится к,медицине, а именно к иммунохимии. Целью изобретения является упрощение способа. Способ осуществляется посредством обработки полимерной матрицы метанолом или диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 24-48 ч. 2 ил.

СОК)З СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

rsiIs G 01 N 33/531, 33/543

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4710040/14 (22) 23.05.89 (46) 07.02.92. Бюл. М 5 (71) Институт биоорганической химии АН;

БССР и Хозрасчетное опытное производстВо Института биоорганической химии АН

БССР (72)Д. Т. Кожич, Е. С, Кудина, А. В. Смирнов, С, П. Марцев, В. А. Прейгерзон и И, И. Бовдей (53) 616.089.22(088.8) (56) Заявка ФРГ

N. 3111474, кл. G 01 N 33/54, опубл. 1982.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии.

Целью изобретения является упрощение способа.

Пример 1. Полимерные шарики из полистирола помещают в 150 мл растворителя (диметилсульфоксид) и выдерживают

48 ч при 20 С. Затем шарики отфильтровывают и остатки растворителя удаляют.

Применение твердофаэного носителя.

На фиг. 1 показана проверка твердофазных носителей с адсорбированным белком в радиоиммунологическом тесте: кривая 1— полистирольные носители, необработанные растворителем; кривая 2 — обработанные диметилсульфоксидом.

Используют твердофазные носители с поверхностью 0,90-0,95 см без обработки и обработанные диметилсульфоксидом. В ка-честве белка для адсорбции используют ферритин селезенки человека. Адсорбцию белка проводят в 0,01 М натрийфосфатном буфере (рН 7,2) с последующей промывкой этим же буфером, содержащим 0,17ь Твин20. Твердофазные носители с адсорбированным ферритином инкубируют в растворе

0,05 М натрий фосфатного буфера (рН 7,4) с

„„. (. „„1711080 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, Целью изобретения является упрощение способа. Способ осуществляется посредством обработки полимерной матрицы метанолом или диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 24-48 ч, 2 ил.

1 (, бычьего сывороточного альбумина и

0,15 М NaCI, содержащем различные концентрации антител к феуритину, меченных йодом-125. Фракция J-антител имеет

1 удельную активность 5 мкКи/мкг(185 ГБк/г) и радиохимическую чистоту 92 ф,. Инкубацию продолжают 3 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании, Затем раствор удаляют отсасыванием, и твердофазные носители промывают дистиллированной водой, после чего измеряют радиактивность твердофазных носителей с адсорбированным ферритином, Как следует из представленных данных на фиг. 1, величина сигнала связывания в

2-3 раза ниже и наклон кривой доза-эффект значительно меньше при использовании носителей, полученных контрольным способом, что не позволяет точно дискриминировать близкие концентрации определяемого вещества.

На фиг. 2 показана проверка твердофазных носителей с адсорбированным белком в двухцентровом иммуноферментном тесте; кривая 1 — полистирольные носители необработанные растворителем; кривая 2 — обработанные диметилсульфоксидом.

1711080

Минимальная определяемая концентрация (чувствительность) в двухцентровом иммуноферментом анализе (в нг/мл) Используют твердофазные носители с поверхностью 0,90-0,95 см, обработанные 2 диметилсульфоксидом. 8 качестве белка для адсорбции применят антисыворотку барана против иммуноглобулинов G кролика. 5

Адсорбцию белка проводят по вышеуказанному. Твердофазные носители с адсорбированным белком инкубируют в растворе

0,05 M натрийфосфатного буфера (рН 7,4) с

1% бычьего сывороточного альбумина и 10

0,15 M йаС! содержащем различные концентрации иммуноглобулинов G кролика (CalbIochem) и конъюгат аффинно очищенных ослиных антител к JgG кролика с пероксидэазой хрена в конечной концентрации 15

10 M. После инкубации в течение 4 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании раствор удаляют отсасыванием, а твердофазные носители промывают дистиллированной водой. Затем к ним добавля- 20 ют раствор 0,1 M натрийфосфатного буфера (рН 5,9), содержащий 4x10 M тетраметил-4 бензидина (Serva) и 10 M пербората натрия. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном пере- 25 мешивании реакцию останавливают удалением твердофазного носителя и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 655 нм.

Как следует из представленных данных 30 на фиг, 2, носители, полученные предлагаемым способом, дают увеличение чувствительности анализа (снижение минимальной определяемой концентрации) в 2,6-15,8 раз (см, таблицу 2). 35

Пример 2, Полистирольные шарики обрабатывают 24 ч при комнатной температуре в метаноле по примеру 1 и помещают в пробирки для анализа, На полистирольные шарики наносят антитела к ферритину 40 по примеру 1. Затем добавляют 0,3 мл раствора, содержащего ферритин в концентрациях от 4 до 250 мкг/л (калибровочные пробы) либо контрольные сыворотки с известным содержанием ферритина и инкубируют 3 ч при комнатной температуре и вертикальном встряхивании. Супернатант удаляют, шарики промывают дистиллированной водой и добавляют 0,3 мл раствора, содержащего меченные йодом-125 антитела к ферритину, После встряхивания в течение

3 ч при комнатной температуре супе рнатант удаляют, промывают шарики дистиллированной водОй и измеряют активность связанных с поверхностью шариков 125-йодантител на гамма-счетчике, Результаты обрабатывают в координатах ВIТ - 1 (концентрация антигена). Точность анализа характеризуют, вычисляя коэффициент вариации результатов многократных измерений одной и той же пробы (контрольной сыворотки или калибровочной пробы), Полученные коэффициенты вариации находятся в пределах 2,8-6,3% для калибровочных проб и 3,6-8,5 % для контрольных сывороток, что свидетельствует о соответствии параметров точности анализа современным требованиям, Способ более прост, т,к. позволяет избежать гамма-облучения носителя.

Формула изобретения

Способ получения твердофазного носителя для иммунохимического анализа, включающий стадию обработки поверхности синтетического органического полимера, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, поверхность полимера подвергают обработке метанолом или диметилсульфоксидом при комнатной температуре в течение 24-48 ч, 171.1080

-Э

В х 10, cpm

140 во

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Э.О

lg (АЬ), нг в пробе

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05.

0.О

0.5

1.0

1.5

2.0 2.5

1g (IgG), нг/ил Риг. 2

Составитель С. Мельников

Редактор M. Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор И. Муска

Заказ 336 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101