Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину g павианов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4803739/13 (22) 19.03.90 (46) 15.02.92.. Бюл, N. 6 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и медицины

AMH СССР (72) И.H.Êëoö, А.Ф.Воеводин, Т.Г.Талло и И.Г.Зоделава (53) 578.085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1454850, кл. С 12 N 5/00, 1986. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ. КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

IVIUSCULUS L.-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНУ G ПАВИАНОВ (51) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть применено в меди° е

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть применено в медико-биологических исследованиях, например, для определения иммуноглобулинов 6 у павианов.

Целью,изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (мон-А ), направленные к классоспецифической. детерминанте !96 павианов. Это позволит проводить прямое сравнение данных, полученнь х на павианах, с результатами,: найденными у человека, что крайне важно при моделировании ряда заболеваний человека на обезьянах.

Штамм гибридных клеток ПГ61(гибридома) получают путем слияния мышиной ми„„Я „„1712411 А1 ко-биологических исследованиях, например, для определения иммуноглобулинов G павианов. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антйтела (МонАТ), направленные к классоспецифической детерминанте IgG павианов, Гибридные клетки получены при слиянии спленоцитов мыши, иммунизированной lgG павианов-гамадрилов с мышиной миеломой. Отбор клонов проводили по равной реактивности

Мон-AT ПГ6 с IgG трех видов павианов и челов ка. Специфичность Мон-AT. к тяжелым цепям IgG подтверждена вестерн-блотингом. Штамм гибридных клеток ПГ6 прошел три. этапа клонирования методом предельных разведений. Штамм депонирован во ВСКК(П) под номером 376Д. еломы Х63-А, 8;653 с клетками селезенки .

° wi мыши ВА В/с, иммунизированной IgG павиана-гамадрила. Отбор продуцирующих фь

МКА клонов на первом этапе проводят с помощью IgG павиана-гамадрила. Наиболее реактивные клоны тестируют на реактивность с igG других видов рода павианов: анубиса (papio anubis) и гвинейского павиана (papio papio) Гидридому, имеющую одинаковую реактивность с IgG этих видов, проверяют в вестерн-блотинге на секрецию мон-АТ против тяжелых цепей lgG павианов.

Далее гибридома прошла три этапа клонирования методом предельных разведений.

Штамм ПГ6 депонирован в.коллекцию

Института Цитологии АН СССР. Ниже дается характеристика штамма гибридамы:

1712411

1. Регистрационный номер ВСКК(П)

376Д. авторское наименование штамма;

ПГ6ь

2. Причины депонирования: продуцент моноклональных антител против IgG павианов.

3. Д Родословная штамма:

Клетки миеломы Х63-Ag 8.653 + клетки селезенки мыши BALB/с. иммунизированной igG павиана-гамадрила, сливающий агент — ПЭГ 6000, селекция клеток на среде

КАТ, 3 клонирования методом предельных разведений (1 клетка/3 лунки).

4, Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 7.

5. Стандартные условия выращивания; среда RPMI — 1640 + 15% FCS, 37 С, газовая фаза — воздух+ 5 Д СО .

6. Культуральные свойства: способ культивирования — в стеклянных или пластиковых флаконах на 50 — 250 мл, посевная доза — 500,000 клеток/мл, кратность рассева — 1:2, время субкультивирования 3 — 4 дня.

7. Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: мышь

BALB/с, обработанная пристаном /1 мл, в/б за 10 дней до инокуляции/, доза инокуляции —.5 — 10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней. ,8. Данные по видовой принадлежности: мышиные клетки линии BALB/с, 9. Маркерйые признаки и методы их, оценки: гибридома секретирует Мон AT против тяжелых цепей IgG павианов, определяе.мые иммуноферментными, иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими методами.

10. Контроль контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами: контаминации бактериями, грибами и микроплазмы нет.

Один из родительских клеток продуцируют эндогенный ретровирус С-типа мышей;

11. Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом: мон-AT IgG— класса, направленные к классоспецифической детерминанте тяжелых цепей, lgG павианов: специфичность оценивалась иммуноферментным методом и вестернблотин гом.

12. Концентрация полезного продухта (моноклональных антител) в среде около 10 мкгlмл, в асцитной жидкости около

10 мг/мл;

Титры данных антител при определении с помощью твердоазного иммуноферментного метода около 2х10 (среда/ и 2х10-6/асцит при концентрации антитена 1 мкг/мл.

Определение антител можно проводить также иммунофлюоресцентными и радиоимму5 нологическими методами. Продукция моноклональных антител стабильна, по крайней мере, в течение 9 пассажей in vitro, 13. Способ криоконсервации:

10 5 — 6 млн клеток e FCS + 10% DMSO, программное замораживания около 907, (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего).

Использование штамма илюстрируется

15 следующими примерами:

Пример 1. Сыворотки трех видов, павианов (анубиса, гвинейского и гамадрила} используют для приготовления 2-кратных разведений, начиная с 1:2000, В лунке

20 96-луночных пластинок для твердофазного . иммуноферментного анализа вносят приго-, товленные разведения сывороток обезьян.

Параллельно используют такие же разведения сыворотки человека. При этом происхо25 дит сорбция белков сыворотки на пластине лунок. Несвязавшиеся белки удаляют, свободные адсорбционные точки блокируют

8 -ным раствором сухого обезжиренного молока, после чего в лунки вносят разведе30 ние либо асцитной жидкости Мон-AT ПГ6, либо прототип — мон-АТ6з (3:2000). После инкубации в течение 1 ч при 37 С лунки промывают для удаления несвязавшихся антител, вносят антимышиный конъюгат.

35 меченный пероксидазой, и проводят стадии инкубации и отмывки, Затем в лунке добавляют раствор о-фенилендиамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превращает в окрашенное соедине40 ние. Степень окраски, измеренная при 492 нм, пропорциональна концентрации IgG в сыворотке. Из получаемых результатов следует, что мон-AT ПГ6! одинаково хорошо реагирует с IgG всех трех видов павиата и

45 человека. Отношение оптических плотностей для разведения1;4000 при 492 нм, полученных на сыворотках павианов, к оптической плотности, полученной на сыворотке человека, при использовании мон-AT

50 ПГ6 равны 0,97:0,85, 1,39 (среднее 1,04), тогда как MKA бз хорошо реагирует с сывороткой человека, но практически не реагирует с сыворотками павианов. Отношение, близкое к единице, позволяет проводить

55 прямое сравнение данных, полученных при определении антител196 класса у павианов, с результатами, полученными у человека.

Пример 2. Навески IgG трех видов павианов и человека в количестве 10 мкг каждого на трех кипятят в течение 5 мин на

1712411

Составитель А. Маныкин

Редактор В. Трубченко .. Техред М,Моргентал Корректор О. Кундрик

Заказ 510 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1.13035, Москва,Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 водяной бане в буфере для образцов, содержащем мер — каптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей и . при электрофорезе иммуноглобулины раз деляют.на тяжелые и легкие цепи. Белки 5 элюируются электропереносом на нитроцеллюлозу, которую инкубируют в 8 -ном растворе сухого молока для блокирования свободных адсорбционно-активных точек.

Определение ведут в двух параллельных об- 10 разцах. Первую половину инкубируют с мон-АТ Оз (прототип), а вторую с Мон-AT

ПГО (1:500) в течение 2 ч при 37 С. После отмывки несвязавшихся антител нитроцеллюлозу инкубируют и повтор 2 ч при 370С с 15 антимышиным конъюгатом, меченным- пероксидазой, и повторяют отмывку. Пероксидаза в. присутствии перекиси водорода переводят субстрат-диаминобензидин в окрашенное соединение, причем только s том месте, где Мон-АТ взаимодействует со своим антигеном. В данном случае, прототипМон-АТ Оз, реагирует с тяжелыми цепями только Ig6 человека, тогда как предлагаемое Мон AT ПГО реагирует с тяжелыми цепями человека и всех трех видов павианов.

Полученные результаты показывают,, что в отличие от прототипа, Мон-АТ ПГО направлено к классос ецифической детер минанте, общей для тяжелых цепей }g6 павианов и человека.

Ci о р мул а и зоб рете ни я

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus muscufus L. ВСКК(П) Ь

376.Д-продуцент моноклональных антител к иммуноглобулину 6 павианов.