Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus - продуцент моноклонального антитела к антигену @ -клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 кд

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано вмедицине для изучения патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета и иммунодиагностики. Цель изобретения - повышение специфичности моноклонального антитела. Полученный штамм гибридрмы C10G7 депонирован под номером ВСКК (П) Ns 251D. Штамм продуцирует моноклональное антитело изотипа УдС 2, при этом продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей In vtvo. Антитело обладает специфичностью к антйгену /8-клето1$. поджелудочной железы с мол.м. 64 КД. С антителом связывается 76±6,1% "культивируемы)? островковых клеток..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4395435/13 (22} 03.02.88 (46) 15.02.92. Бюл. hh 6 (71) Институт иммунологии (72) Е.Н.Злобина (53) 578.085.23 (088.8), (56) Mari J., Jokono К. et al. In Y.Diabetes 1986, 35, 5, р, 517-522. (54} ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ MOHOKJlOHAJlbHOCO АНТИТЕЛА К

АНТИГЕНУ 8-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ С МОЛ.М. 64 Kfl, (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в медицине для изучения патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета и иммунодИагностики, Цель изобретения — повы шение специфичности моноклонального антитела.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинно 2 10 островковых клеток, полученных при переваривании коллагеназой-трипсином поджелудочным желез новорожденных крысят Вистар; Через 24 дня иммунизацию повторяют аналогичным способом, а через 14 дней вводят те же клетки внутривенно. Спустя еще 4 дня клетки селезенки иммунных мышей сливают с клетками мышиной миеломы Р3-Х6Х-Ag8.653 с помощью 50%-ного полиэтиленгликоля с

„„ЯХ„„171241O А1 (st)s С 12 N 5/00, А 61 К 39/395 медицине для изучения патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета и имму- нодиагностики. Цель изобретения— повышение специфичности моноклонального антитела. Полученный штамм гибридомы

C10G7 депонирован под номером BCKK (П)

М 2510. Штамм продуцирует моноклональное антитело изотипа YgG 2, при этом продукция антител сохраняется в течение. 30 пассажей в культуре и 20 пассажей In vivo.

Антитело обладает. специфичностью к антигену Р-клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 КД. С антителом связывается

76 -6,1% культивируемых островковых клеток. мол.м. 1500. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы 5:1. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные пластинки по 10 клеток на лунку, в которую предварительно были высеяны перитониальные макрофаги мыши BALB/с по 104 клеток на лунку. Селекцию гибридомы ведут в мини.мальной среде Игла, модифицированной

Дульбекко, содержащей 10404 эмбриональной телячьей сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 10 M аминоптерина и 1,6 10 5 М тимидина. Гибридому дважды клонируютиз расчета 1 клетки на лунку. Доля клонов, сохранявших продукцию антител заданной специфичности, не ниже 90% при обоих клонированиях.

Штамму -дано условное название

C10G7, депонирован под номером ВСКК(П)

hh 251D и характеризуется следующими признаками.

1712410

Культуральные признаки, Среда для культивирования — минимальная среда Игла, модифицированная

Дульбекко, содержащая 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 2mM L-глютамина, 100 ед/мл гентамицина и 5 10 М 2-меркап-5 тоэтанола. Оптимальная концентрация клеток при культивировании 5 10 клеток/мл.

Посевная доза 10 клеток в мл, Время субкультивирования 3 — 4 дня. Гибридома хорошо живет и размножается в стандартных условиях для культивирования исходной миеломы. Клетки выдерживают семидневное культивирование без смены питательной среды при исходном засеве 50 10 клеток/мл с постепенным снижением жизнеспособности до 20-30% после периода максимального нарастания. Время удвоения культуры, определенное путем прямого подсчета количества клеток в 1 мл суспензии, меняется от 24 до 78 ч в зависимости от условий культивирования.

Культивирование! и, vivo, При пассировании гибридомы на мышах BALB/c доза клеток при прививке 5.10 клеток..Время образования ацита 8 — 12 дней. Гибридома сохраняет продукцию антител в течение 30 пассажей в культуре и 20 пассажей на мышах BALB/c, обработанных пристаном за 10 дней до введения гибридомы..

Морфология клеток штамма C10G7.

Клетки однородны по размерам, округлой формы. Большинство клеток имеет округлое ядро. Ядра крупные, располагаются преимущественно в центре клеток или несколько смещены к периферии. Ядра занимают большую часть объема клеток.

Цитоплазма узким ободком располагается вокруг ядра. При окраске по РомановскомуГимза ядро имеет красновато-фиолетовую окраску цитоплазма — голубую окраску.

Включений в цитоплазме не наблюдается, Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела (монАТ), продуцируемые штаммом C10G7, специфически реагируют с антигеном ф-клеток поджелудочной железы с мол.м. 64 КД; монАТ не реагируют с клетками крови, тимоцитами, спленоцитами, клетками щитовидной и слюнной железы, ацинарной тканью поджелудочной железы, клетками печени. Изотип антитела — Yg G2b, Контаминация. Контаминации бактериями, грибками и микоплазмами не обнаружено.

Консервация клеток.

Гибридому криоконсервируют в культуральной среде, содержащей 507 эмбрио10

15 нальной телячьей сыворотки и 10 диметилсульфоксида, Режим замораживания; 1 градус в мин, до -70 С, далее клетки переносят в жидкий азот, Рэзмораживают гибридому при переносе ампулы с клетками из жидкого азота в.водяную баню при 37 С

Жизнеспособность клеток после хранения в жидком азоте около года не ниже 70, судя по включению красителя эозина и трипанового.синего.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридому высевают при плотности 5 10 клеток/мл в пластиковый

5 флакон с минимальной средой Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей

10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2mML-глютамина, 100 ед/мл гентамицина и

5 10 М 2-меркаптоэтанола, Клетки культи20 вируют 3 — 4 дня при 37ОC в атмосфере с 5%

COg. Далее культуральную жидкость соби-. рают, центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин, а супернатант используют в качестве источника антител.

25 Поджелудочные железы 40 новорожденных крысят Вистар обрабатывают коллагеназой-трипсином, затем трипсином-ЭДТА-ДНКазой. Клетки помещают в среду Игла в модификации Дульбекко с 10%

30 телячьей сыворотки эмбриональной и культивируют при 37 С 24 ч в атмосфере с 5

COz на пластиковых чашках Петри. Затем клетки снимают с чашек Петри и отмывают буфером без кальция и магния, Клетки под35 считывают в камере Горяева, 10 клеток инкубируют 30 мин при 37 С в среде, из которой затем берут пробу на продукцию инсулина, Уровень бэзальной секреции инсулина на 10 островковых клеток составит

40 560+65 мкг/мл. После контроля на активность, 0;5 10 осгровковых клеток инкубируют 30 мин при 4 С в 50 мкл раствора монАТ. Клетки 2 раза отмывают, центрифугируя при 1000 об/мин 10 мин и суспенди45 руют в 50 мкл кроличьих энтимышиных антител, конъюгированных с изотиоцианатом флуоресцеина. Через 30 мин инкубации при 4 С клетки отмывают, суспендируют в

100 мкл 1 параформальдегида. Флуорес50 ценцию регистрируют с помощью проточного цитометра. Долю светящихся клеток определяют при просчете 20000 островковых клеток.

При 30 кратном скриннинге на культи55 вируемых QGTpoBKoBblx клетках обнаружено связывание 76 +6,1 клеток с монАТ, продуцируемого гибридомой C10G7, Пример 2. Фрагмент поджелудочной железы 0,5х0,5 см замораживают в жидком

1712.410

Составитель Й. Привалова

Техред M.Ntoðãåíòàë Корректор О. Кундрик

Редактор Ю. Середа

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательски9 комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 азоте. Затем переносят в охлажденную камеру криостата при 20 С и изготавливают криосрезы толщиной 6 — 8 мкм. Каждый срез наносят на стекло с 50 у поли-1-лизина и фиксируют в течение 1 с нагреванием до 5

36 С. Срезы фиксируют в безводном ацетоне 7-10 мин. Затем переносят в раствор

Трис-NaCI и инкубируют 5 мин. Срезы переносят во влажную камеру, наносят по. 50: мкл супернатанта гибридом С1067 и ин- 10 кубируют 60 мин при комнатной температуре. Затем трижды отмывают по 5 мин погружением в сосуд с Трис-йаО, После этого на срезы наносят по 50 мкл кроличьих антимышиных антител, конъюгированных с 15 пероксидазой, и инкубируют 60 мин при комнатной температуре. Повторяют отмывку указанным способом. Проводят под контролем зрения докраску диаминобензидином. Продукт иммунопероксидаэного ок- 20 рашивания островковых клеток с монАТ учитывают на световом микроскопе.

При 20 кратном скриннинге на срезах поджелудочной железы обнаружено окра-шивание клеток, находящихся в зоне распо- 25 ложения Р-клеток.

Пример 3. Срезы поджелудочной железы получают кэк описано в примере 2.

Срезы обрабатывают монАТ к инсулину, и монАТ, полученными из штамма C10G7, Да- 30 лее срезы отмывают, обрабатывают. кроличьими антителами, коньюгированными с пероксидазой, .и регистрируют окрашивание Р-клеток так же, как в примере 2.

В результате проведенных опытов показано, что монАТ, продуцируемое гибридомой C10G7, специфически реагируют с мембранным антигеном с мол.м. 64 КД onровковых клеток поджелудочной железы крысы и человека.

Для выяснения природы островковых клеток, несущих антиген с мол.м. 64 КД проведено сопоставление окрашивания клеток монАТ к инсулину. В.результате показано, что монА к инсулину и монАТ к антигену реагируют с одними и теми же клетками островков Лан-герганса: монАТ-к антигену с поверхностью, а MQHAT к инсулину — с цитоплаэмой Р-.клеток, Антиген, выявляемый антителом, секретируемым штаммом

G10G7, обнаруживается только на инсулинпродуцирующих клетках поджелудочной железы как человека, тэк и крысы. Данный антиген имеет мол.м. 64 КД. Известно, что в сыворотке больных сахарным диабетом! типа присутствуют антитела к этому антигену и антиген является органоспецифическим и патогенетическим маркером этого заболевания.

Таким образом, штамм секретирует моноклональное антитело, выявляющее антиген с мол.м. 64 КД, имеющий решающее значение в развитии аутоиммунного компонента при заболевании инсулинэависимым сахарным диабетом, с помощью продуцируемого штаммом монАТ удается выделить антиген, сферический для инсулинпродуцирующих клеток поджелудочной железы, и тем самым-в дальнейшем проводить иммунодиагностику сахарного диабета

1 типа.

Формула изобретению

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus ВСКК(П) М 2510 — продуцент моноклонального антитела к антигену

Р-клетокподжелудочйой, железы с мол.м.

64 КД.