Способ генетической дактилоскопии

 

, Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине. Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидуума в отдельности. В качестве генетических маркеров предлагается использовать не только величину ВТП, но и особенность распределения метильных групп на 5' -м фланке протоонкогена HA-RAS 1 в геноме людей.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 Q,1/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

-ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Й (21) 4757857/13 (22) 14,11;89 (46) 15.02.92. Бюл, hL 6 (71) Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н.Н.Петрова (72) Л.Б.Новиков, С.Н.Федоров, О,С,Яцук, Г.И.Леванова, В,П.Калиновский и К П.Хансон (53) 577.224.2:577.2 (048) (088.8) (56) Lucler G.W. and Hook G.E.R.

Environmental Health Perspectives. Eds.

Geneva, 1987, ч. 76, р. 147 — 153.

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине, Известны следующие способы использования индивидуальных признаков человека: дактилоскопия, лабораторный анализ естественных выделений человека (слюны, пота, спермы и т.д.), определение группы крови и др. Однако перечисленными сгособами трудно определить происхождение тканей,и клеток, т.е. их принадлежность к определенному индивидуму или к определенному клону клеток человека, культивируемых In vitro.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения генотипа по длине вариабельного тандемного повтора (ВТП), расположенного на 3 -м фланке протоонкогена НА-RAS 1 человека. Для;этого геномную ДНК, гидролизованную ферментом Msp 1, гибридизуют в.жестких условиях с 2Р-ДНК-пробой, содержащей последова(54) СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ (57), Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине. Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидуума в отдельности. В качестве генетических маркеров предлагается использовать не только величину BTR, но и особенность распределения метильных групп на 5 -м фланке протоонкогена НА-RAS 1 в геноме людей. тельности протоонкогена НА-RAS 1 человека (проба ДНК вЂ” EJ 6.6), и методом авторадиографии выявляют специфические рестрикционные фрагменты ДНК. Так было а .установлено 32 аллельных варианта прото- 4 онкогена НА-RAS 1, которые присутствуют в геноме людей разных этнических групп. Аллели At, А2, А3 и А4 (часто встречающиеся) р обнаружены у 91,37 обследованных людей;

А1,2, А1.1, А4.1, А0.1, А1.3, А1.4 и А5 (средне встречающиеся) — у 5,67; остальные (ре- О дкие: А3.2, А2.2, А2.3, А2.4, А3.1, А3.3, А3.4, А1.35, А2.01, А3,5, А4.2, А0.15, А0.2, А1.25, А2,010, А2 02, А2,020, А2,1, А2.11, А2.12, А5.2) — только у 3,1 людей. Диплоидный геном человека содержит два аллеля протоонкогена НА-RAS 1, которые могут быть как равной длины (гомозиготный вариант), так и разной (гетерозиготный вариант), Таким образом, используя в качестве маркера длину

ВТП HA-RAS 1 ° всех людей можно разделить на 32 группы, что равно 1024, Поскольку

1712419 аллели А1, А2, АЗ и А4 встречаются чаще протоонкогена НА-RAS 1, обусловленного всего, то в популяции людей превалирует индивидуальностью в распределении метолько 16(4 ) вариантОв генотипа НА-RAS1, тильных групп у наружного цитозина в поостальные же — значительно реже. Причем, следовательностях ЦЦГГ геномной ДНК.

61 людей содержит аллель А1, 12 — А2, 5 Пример. Использование протоонко9,7 — АЗ и 8,8 — А4. Отсюда следует, что гена НА-RAS 1 в изучении генотипа больных основной недостаток прототипа заключает- раком желудка. ся в том, что он позволяет разделить всех Для этого выделяли геномную ДНК из людей только на отдельные группы, по- . карцинов и неизмененной слизистой обоскольку сам генетический признак носит по- 10 лочки желудка, а также лейкоцитов крови пуляционный характер. больных. Кусочки ткани (1 r.) гомогенизируЦель изобретения — повышение чувст- ют в 10 мл TNE-буфера (10 мл трисНС, рН вительности способа за счет использования 8,0, 0,15 M NaCL, 1 мМ ЭДТА). Клетки гомомаркеров, специфичных для каждого инди- гената лизируют прибавлением раствора

15 SDS до конечной концентрации 1 и подСпособ заключается в том, что в качест- вергают фенольной экстракции в течение ве генетических маркеров предлагается ис- 10 мин при комнатной температуре при инпольэовать не только величийу ВТП, но и тенсивном перемешивании. Смесь центриособенность распределения метильных фугируютпри2000ц10мин при4 С, Водную групп на 5 -м фланке протоонкогена НА-RAS 20 фазу забирают и повтбрно экстрагируют фе1, Для этого геномную ДНК гидролизуют налом в том же режиме до исчезновения ферментом Msp 1, гибридизуют в мягких ус- интерфазы (3 — 4 раза). Затем к водной фазе ловиях с пробой EJ 6.6(онкогеном НА-RAS прибавляют 2 объема этанола и получают

1) и выявляют рестрикционные фрагменты, осадок хромосомной ДНК, Хромосомную принадлежащие 3 -му и 5 -муфланкам про- 25 ДНК обмывают 70 -ным этанолом и растоонкогена НА-RAS 1. На 5 -м фланке про- творяют в дистиллированной воде. тоонкогена НА-RAS 1 имеется 32 участка, Концентрацию ДНК в растворе (мгlмл) узнаваемых ферментом Msp I. Эндонуклеа- определяют на спектрофотометре при за рестрикции Msp I узнает последователь- длине волны 260 нм. ность ЦЦГГ и не расщепляет ее, если 30 Венозную кровь (20 — 30 мл) больных нанаружный цитозин метилирован. Метилиро- сыщают гепарином (20 ед/MLl), разбавляют вание цитозиновых оснований (Ц) на 5 -м 1/10 объема физиологическим раствором и о фланке протоонкогена НА-RAS 1 имеет при- центрифугируют при 1000g 10 мин при 4 С., знаки индивидуальной специфичности и не Плазму удаляют, а лейкоцитарную пленку зависит от тканевой принадлежности кле- 35 используют для выделения ДНК по описанток. Кроме того, метильные группы у наруж- ной методике. ного цитозина в последовательностях ЦЦГГ К 10 мкг ДН К прибавляют 50 ед эндонукпротоонкогена НА-RAS 1, которая сохраня- леазы рестрикции Msp I и рестрикционный ется даже в ДНК злокачественных опухолей " буфер, Реакционную смесь инкубируют при и их метастазов, присутствуют с высокой 40 37 С в течение 10 — 16 ч при периодическом стабильностью. Достоверность результа- встряхивании пробирок: Для проверки качетов, полученных предлагаемым способом, ства используемого фермента параллельно достигается черезвычайно низкой вероятно- с гидролизом основных препаратов ДНК вестью выявления одинаковой рестрикцион- дут энвиматическую фрагментацию ДНК фаной картины в ДН К разных людей. Для 5 -ro 45 га А в тех же условиях. фланка протоонкогена НА-RAS 1 число воз- Гидролиз препаратов ДНК останавможных вариантов равно 32 (по ферменту ливают непосредственно перед элект32

Msp 1) и 32 для 3 -го фланка НА-RAS 1 (по рофорезом, добавляя к ним 1/10 объема длине ВТП), т.е. всего 32 + 32 =10, В наслаивающего буфера, содержащего 70 этом уравнении второй показатель слева 50 глицерина, 0,5 бромфенолового синего и служит для сужения поиска до опреде- 0,2 M ЭДТА, рН 8,0. ленной группы лиц, а первый — для не- Электрофорез гидролизованных препапосредственной идентификации объекта ратов ДНК ведут в 1,5 геле агарозы, приисследования по ийдивидуальному гене- готовленном на трис-ацетатном буфере (40 тическому признаку. Величина и число 55 мМ трисНО, рН 8,0, 20 мМ ацетата Na„2 мМ дополнительных Msp — рестрикционных ЭДТА). Продолжительность электрофореза фрагментов, не нарушается даже вДНКзло- составляет 10 — 12 ч при напряжении электг качественных опухолей и их метастаз, что рического поля 2 — 3 B/cì, Для определения подтверждает стойкость выявленного гене- размеров рестрикционных фрагментов остического признака — ПДРФ 5 -го фланка новных препаратов ДНК ведут параллель1712419

Составитель Л; Новиков

Редактор Л. Пчолинская Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О, Кундрик

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

1 ный электрофорез ДНК фага А, гидролизованной ферментом Nlnd !!! или Pst I.

После электрофореза гель агарозы окрашивают в растворе этидия бромида (1 мг/мл), фотографируют в УФ-свете и об- 5 рабатывают 0,25 M НС! в течение 10 мин;.

Затем гель помещают в прибор для переноса фрагментов ДНК на нейлоновые фильт; ры. Элюцию ДНК проводят в условиях 0,4

M Na0H 12 — 16 ч. Фильтр споласкивают в 10

2-кратном SSC (1-кратный SSC содержит

0,15 M NaCI, 0,015 М цитрата Na, рН 7,0) и подсушивают на воздухе, Сухие фильтры можно хранить между листами фильтровальной бумаги неограниченное время. 15

Для выявления Msp !-рестрикционных фрагментов протоонкогена НА-RAS 1, нейлоновые фильтры, содержащие рестрицированную геномную ДНК, гибридизуют с пробой EJ 6.6, предварительно меченной 20 радиоактивным фосфором (Р-а ДЦТФ) в реакции ник-трансляции. Гибридизацию ведут 16-20 ч при 60-62 С в растворе следующего состава: 3-кратный SSC, 0,17 SDS, 0,5 мг/мл дрожжевой тРНК и 5-кратный 25 реагент Денхардта (50-кратный реагент

Денхардта содержит фикол, поливинилпирролидон, бычий сывороточный альбумин по

5 гр на 500 мл Н20), 30

Отмывку фильтров от непрогибридизовавшейся пробы ДНК осуществляют в трех режимах: сперва при комнатной температуре в четырех сменах раствора 2-кратного

SSC и 0,17 SDS, затем при 37 С втечение 35

2 ч в четырех сменах того же раствора, после этого при 50 С в течение 2 ч в четырех сменах раствора 0,1-кратного SSC и 0,1 SDS, Отмытые фильтры сушат в термостате при

37 С.

Высушенные после гибридизации фильтры экспонируют на рентгеновской пленке в кассетах с усиливающими экранами в течение 3 — 10 сут.

Продолжительность исследования составляет 15 дней.

Как видно из примера. использование предлагаемого способа изучения генотипа людей на основании особенностей структуры 3 и 5 фланков протоонкогена НА-RAS

1 позволило разбить обследованных больных на 4 группы и выявить генетические признаки, присущие каждому индивидуму в отдельности.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет на генетическом уровне установить принадлежность ткани (клеток) определенному человеку; определить происхождение кусочков тканей или клеток, принадлежат они одному лицу или разным; проверить клональность популяции клеток в культуре и степень их,загрязнения клетками иного происхождения в ходе научных работ.

Формула изобретения

Способ генетической дактилоскопии, включающий определение генотипа по длине вариабел ьного тандемного повтора, расположенного на 3 -м флэнке протоонкогена HA-RAS 1 человека, о т л и.ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа за счет исполл ьзо ва ни я ма рк еров, специфичных для, каждого индивидуума, определяют распределение метильных групп на 5 -м фланке протоонкогена НА-RAS 1,