Способ выявления нуклеотидных последовательностей

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов , а также в научных исследованиях. Цель изобретения - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций. Предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей .

СО103 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1678838 А1 (я)л С 12 Q 1/68

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4686597/13 (22) 03.05.89 (46) 23,09,91. Бюл, N. 35 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) А,Л,Мельников, И.В.Домарадский и

А.В.Дроздов (53) 575.224,2:577.2 (088,8) (56) Talkow S„Moseley S, Specific 0Na proter

ln diagnostic microbiology. — USA Patent, 1982, ¹ 4358535. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов, а также в научных исследованиях.

Цель изобретения — ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций.

При выявлении нуклеотидных последовательностей, комплементарных нуклеотидным последовательностям эталонного образца, предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей.

Способ осуществляют следующим образом.

Эталонные образцы предварительно наносят на поверхность носителя, фиксируют их тепловой обработкой и предгибриди(57) Изобретение относится к молекулярной . биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов, а также в научных исследованиях, Цель изобретения — ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций. Предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей. зуют. Маркированию, например сульфированию, подвергают исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей непосредственно в процессе лизиса бактериальных клеток или тканей, инфицированных вирусами, Общее время обработки и маркировки исследуемого материала до его взаимодействия с фиксированными на носителе эталонными образцами занимает 3 ч. Носитель с эталонными образцами подвергают взаимодействию с маркированным исследуемым материалом и отмывают избыток материала. Факт комплементарного взаимодействия нуклеотидн ых последовател ьн остей эталонного образца и исследуемого материала устанавливают иммуноферментным методом.

Пример 1. Бактериальную культуру штамма Е.coll TG l с плазмидой pTZ 18R выращивают с аэрацией при 37 С в L-бульоне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, до концентрации 2х10 кл,/мл. Бактериальв

1678838 ную культуру лизогенного по фагу !. штамма

Е.со!! CSH 45 (Л С 1857S7} выращивают аналогичным образом в L-бульоне без антибиотика. Бактериальную культуру штамма

В.sub

Клетки из 1 мл каждой бактериальной культуры осаждают центрифугированием при

2000g в течение 5 мин и суспендируют в 0,2 мл ТЭН-буфера, содержащего 0,05 M трисHCi, 0,001 M ЭДТА, 0,025М натрия хлори- стого, рН 8,0, Такие суспенэии клеток используют в качестве исследуемого материала. Все дальнейшие операции, кроме специально укаэанных, проводят при комнатной температуре, Для обработки и маркировки исследуемого материала предлагаемым способом к суспензии клеток прибавляют 0,05 мл раствора лизоцима B ТЭН-буфере с концентрацией 4 мг/мл. Через 10 мин добавляют 1,35 мл лизирующего раствора, содержащего 6,0

M гуанидинхлорида, 0,1 МЭДТА,,0,,05 М трис-HCI, рН 8,0, и перемешивают в течение

5 мин до полного лизиса клеток. Прогревают лиэат при 65"С в течение IO мин, затем пять раз пропускают лизат через иглу с помощью шприца на 5 мл. К лизату добавляют

2 мл раствора 1,0 M метилгидроксиламина, рН 6,0 и 8 мл раствора 2,0 M метабисульфита натрия, рН 6,0. Через 1 5 ч прибавляют 11 6 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 15 мин. Затем осаждают сульфированные нуклеотидные последовательности центрифугированием при 5000g в течение 15 мин, Осадок дважды промывают

70%-ным этиловым спиртом, высушивают на воздухе в течение 15 мин и растворяют сульфированные нуклеотидные последовательности в 0,05 мл ТЭН-буфера, Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами составляет 3 ч.

Для сравнения исследуемый материал обрабатывают на носителе — нитроцеллюлозном фильтре s соответствии с известным способом. Суспензию клеток наносят на поверхность нитроцеллюлоэного фильтра, лиэируют раствором 0,5 М гидроокиси натрия в течение 10 мин, нейтрализуют раствором

1,5 M натрия хлористого, 1,0 М трис-HCI, рН

7,0 в течение 13 мин, затем фиксируют тепловой обработкой при 65 С в течение 2-12

Ч, Предгибридизацию проводят путем инкубации фильтра при 37 С в течение 3 ч в l0 мл гибридизационного раствора, содержащего 50% формамида, GxCCP (1хССР соот20

30 ветствуе раствору 0,15 M натрия хлористого, 0,015 M натрия лимоннокислого), 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% овальбумина, 0,1% додецилсульфата натрия, 75 мкгlмл денатурированной прогреванием при 100 С и фрагментированной ультразвуком ДНК тимуса теленка. Общее время подготовки исследуемого материала на носителе составляет 5,5 — 15,5 ч..

По 0,2 Mfl растворов овальбумина с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере и ДНК тимуса теленка с концентрацией 1 мгlмл B ! Э!-!-буфере подвергают такой же физикохимической обработке предлагаемым способîм, как и бактериальные клетки.

Полученные препараты используют в качестае контрол ьн ы х.

На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов сульфированных нуклеотидных последовательностей из бактериальных клеток и контрольных препаратов ДН К тимуса теленка и овальбумина, Фильтр высушивают на воздухе в течение 30 мин, Для выявления маркированного исследуемого материала и контрольных препаратов используют иммуноферментный метод, Фильтр помещают в 10 мл раствора для блокировки, содержащего буфер ФСБ следующего состава: 0,007 M натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,003 M натрия фосфорнокислого одноэамещенного, 0,12 М натрия хлористого. 0,02% глицияа, 0,3%

Твин-20, рН 7,4, с добавлением овальбумина до конечной концентрации 0,2 мг/мл.

Через 30 мин фильтр переносят в 10 мл буфер ФСБ, содержащего коньюгат иммуноглубулйнов кролика против сульфированной ДНК с перексидазой хрена в разведении 1:200 и выдерживают в течение

1 ч, Фильтр отмывают три раза Ilo 10 мин, каждую поомывку проводят в 20 мл буфера

ФСБ. Затем фильтр погружают-s 5 мл раствора хромогенного субстрата, содержаще45 го 0,2%, бензидина, 0,4 М аммония хлористого, 3% перекиси водорода, 0,02 М

ЭДТА, рН 6,0, Выдерживают 20 с, затем фильтр промывают водой и высушивают на воздухе в течение 15 мин. Оценку результатов проводят визуально, считая за положительный появление сине-голубой окраски.

Иэ результатов следует, что иммуноферментным методом выявляются нуклеотидные последовательности исследуемого материала и контрольной ДНК, но не выявляется препарат контрольного белка, Представленные данные свидетельству от, что предлагаемый способ позволяет вводить специфическую метку в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных

1678838 последовательностей. При этом маркирование белка, составляющего основную часть примесей, не происходит. Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами предлагаемым способом по сравнению с известным сокращается по меньшей мере на 2,5 ч.

Пример 2, В качестве эталонных образцов (зондов) используют ДН К плазмиды pTZ 18R и фага А. Для денатурации ДНК растворы зондов с концентрацией 0,2 мг/мл в ТЭН-буфере прогревают при 100 С в течение 10 мин, На три нитроцеллюлозных фильтра наносят в виде отдельных точек по

0,01 мл растворов зондов. Фиксацию зондов на фильтрах и предгибридизацию проводят в соответствии с известным способом. В качестве исследуемого материала используют суспензии бактериальных клеток штаммов Е,coli TG 1(pTZ 18R), Е,cali

CSH 45 (ХCI 857S7) и Вас.subtilis 168, обработанные и маркированные по методике, описанной в примере 1. Фильтры с фиксированными эталонными образцами помещают в полиэтиленовые пакеты и вносят в каждый по 1 мл гибридизационной смеси, содержащей 0,95 мл гибридизационного раствора и 0,05 мл одного из препаратов маркированного исследуемого материала, Пакеты запаивают и инкубируют при 37 С в течение,24 ч. Удаляют из пакетов гибридизационные смеси. Фильтры отмывают в течение 45 мин, инкубируя их при 65 С в 200 мл раствора 5хССР, 0,1 g додецилсульфата натрия, затем 5 мин в растворе 2хССР при комнатной температуре, Фильтры высушивают на воздухе в течение 30 мин.

Инкубацию фильтров в растворе для блокировки и в растворе конъюгата иммуноглобулинов кролика против сульфированной ДНК с пероксидазой хрена, отмывку фильтров и окрашивание комплементарных нуклеотидных последовательностей в растворе хромогенного субстрата проводят, как описано в примере 1.

Как следует из полученных данных, окраска появляется лишь в точках фиксации эталонных образцов, комплементарных нуклеотидных последовательностям маркированного исследуемого материала. Некомплементарные нуклеотидные последовательности предлагаемым способом не выявляются, Таким образом, предлагаемый способ действительно позволяет выявлять в иссле5 дуемом материале нуклеотидные последовательности, комплементарные эталонным образцам, и применим для идентификации как бактерий, так и вирусов. По сравнению с известным способом, предлагаемый спо10 соб за счет снижения вероятности неспецифических реакций не дает ложно положительных результатов и они имеют однозначную интерпретацию, Преимущества предлагаемого способа

15 перед известным — ускорение анализа и повышение достоверности его результатов путем снижения вероятности неспецифических реакций — достигаются за счет других отличительных признаков — маркировки ис20 следуемого материала (сульфирование) без очистки его нуклеотидных последовательностей и гибридизации маркированного материала с предварительно фиксированными на носителе эталонными образцами, 25 Использованный метод детекции результатов гибридизации является качественным и не позволяет определять количество гибридных нуклеотидных последовательностей. Однако этот метод ис30 пользован лишь для иллюстрации принципиальной осуществимости предлагаемого способа и не является единственно возможным.

Формула изобретения

35 Способ выявления нуклеотидных последовательностей, включающий подготовку носителя, исследуемого материала, эталонного образца, введение метки, проведение реакции комплементарного взаимодейст40 вия на поверхности носителя нуклеотидных последовательностей исследуемого материала и эталонного образца с последующей регистрацией результатов по наличию метки в продукте взаимодействия, о т л и ч а ю45 шийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций, в качестве исследуемого материала используют лизат кле50 ток, метку вводят непосредственно в полученный лизат, а для проведения реакции на носитель наносят эталонный образец, а затем меченый исследуемый материал.