Способ получения l-аспарагиназы

 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения ферментного препарата L-аспарагиназы, используемого в медицине в качестве антилейкозного препарата. Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности фермента. L-аспарагиназуполуча-. ют путем культивирования продуцентов - штаммов Erwinia carotovora - 268, 268М.268M12R, 268MV1 в аэробных глубинных условиях на среде, содержащей источник углерода, источник аминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокулят выращивают на среде, содержащей D-галактозу в качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкоэ1у в качестве основногр источника углерода, и r^люкoзy вводят в питательную среду после 1,5-2,0 ч после начала культивирования в проточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации,, близкой к нулю, в течение всего процесса культивирования. Посевной материал выращивают на среде, содержащей галактозу,в количестве 0,9-1,1%, а основную ферментацию ведут на среДе, содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,8-1,1%. В результате получают биомассу штаммов Erwinja carotovora со средней активностью фермента 20,4 МЕ/мг сухого вещества и выходом фермента в среднем до 83,6» МЕ/мл среды.сл«ч.' Изобретение относится к микробирлогии и касается способа получения ферментного препарата L-аспарагиназы; используемого в медицине в качестве антилейкозного препарата.Цель изобретения - увеличение выхода и удельной активности фермента.Изобретение заключается в том, что продуценты - штаммы Erwlnia carotovora 268, 268М. 268M12R. 268MV1 культивируют в аэробных глубинных условиях на среДе,; содержащей источник углерода, источникаминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокулят выра.щива^т на среде, содержащей галактозу • В качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, и глюкозу вводят в питательную среду после 1,5-2,Оч с начала культивирования в притомном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации, близкой к нулю, в течениеыsQ hO <>&>&

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЯ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4703756/13 (22) 12.06.89 (46) 23.02.92. Бюл. № 7 (71) Институт органического синтеза АН :.

ЛатвССРМ Институт микробиологии им, Августа Кирхенштейна АН ЛатвССР (72) С. В; Лопатнев, Д, Н. Игнас, И. И. Жук, Р. К. Озолинь, П. П. Гривиня, Л. Ф. Савенкова и И.А. Вина (53) 577.15(088.8) (56} Авторское свидетельство СССР

¹ 649746, кл. С 12,N 9/82, 1976.

Авторское свидетельство СССР

N 406877, кл. С 12 N 1/20, 1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АСПАРАГИКАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения ферментного препарата L-аспарагиназы, используемого в медицине в качестве антилейкозного препарата. Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности фермента. L-аспарагиназу.получают путем культивирования продуцентов— штаммов Erwlnia carotovora .— 268, 268М, . Изобретение относится к микробирnorw и касается способа получения ферментного препарата L-аспарагиназы; используемого в медицине в качестве. энти-лейкозного препарата.

Цель изобретения — увеличение выхода

, и удельной активности фермента..

Изобретение заключается в том, что продуценты — штаммы Erwinia carotovora

268, 268М, 268M12R, 268MV1 культивируют в аэробных глубинных условиях на среде, .; содержащей источник углерода, источник

БЫ ÄÄ 1713929 А1 (st)s С 12 N 1/20, С 12 N 9/82/i C12 и 1/20

С 12 R 1:18) 2

268M12R, 268МИ в аэробных глубинных условиях на среде, содержащей источник углерода, источник аминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной . материал и инокулят выращивают на среде, содержащей 0-галактозу в качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, и глюкозу вводят в питательную среду после

1,5-2;0 ч после начала культивирования в проточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации, близкой к нулю, в течение всего процесса культивирования. Посевной материал выращивают на среде, содержащей галактозу,в количестве 0,9-1,1, а основную ферментацию ведут нэ среде, содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,8-1,170, В результате получают биомассу штаммов Erwlnja carotovora co средней активностью фермента 20,4 ME/мг сухого вещества и выходом фермента в среднем до 83,6 МЕ/мл среды.

I аминного азота, минеральные соли и воду, при этом посевной материал и инокулят выращивают на среде, содержащей галактозу в качестве источника углерода, а основную ферментацию ведут на среде. содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода, и глюкозу вводят в питательную среду после 1,5-2,0 ч с начала культивирования в приточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание остаточной ее концентрации, близкой к нулю, в течение

1713929 это обеспечивает сохранение высокого уровня синтеза фермента. всего процесса культивирования. Посевной материал и инокулят выращивают на среде, содержащей галактозу в количестве 0,91,1%, Основную ферментацию ведут на среде, содержащей глюкозу в суммарном количестве 0,9 — 1,1%.

Использование глюкозы в приточном режиме с концентрацией и со скоростью, обеспечивающей потребление ее культурой и поддержание ее остаточной концентрации, близкой к нулю, позволяет избежать репрессирующее действие глюкозы на синтез L-аспарагиназы и обеспечить высокое суммарное количество используемой глюкозы (0,9-1,1%) среды. Последующее введение глюкозы в основную ферментацию после 1.5 — 2,0 ч роста позволяет полностью .использовать остаточную галактозу иноку,лята, Одновременно происходит синхронизация культуры.

Способ осуществляют следующим образом, В качестве продуцента используют культуру Erwlriia carotovora 268 или фагоустойчивую к.;льтуру — Erwlnla carotovora 268M или фаго- -и стрептомицинустойчивую культуру

Erwlnla carotovora 268М/12R, а также Erwlnla

carotovora 268MV1, Основной штамм Erwinia carotovora

268, а также его варианты — штаммы 268М, 268М12Я хранятся в коллекции культур микроорганизмов Института микробиологии им, А. Кирхенштейна АН Лата. ССР, а вариант — штамм 268MVI хранится в коллекции центрального музея промышленных микроУсловия выращивания инокулята: рН среды 6,8-7,0, температура 37 С, аэрация

0,5 объема воздуха на 1 объем среды. Пеногаситель-пропинол Б-400.

После бч роста культуральную жидкость в объеме 50 л из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с объемом культуральной жидкости 500 л. Введе10 ние глюкозы в рабочий ферментер производят через 1,5 — 2,0 ч после засева. За этот период происходит полное потребление галактозы, оставшейся в культуральной жидкости инокулята, и одновременно синхронизация культуры. При этом глюкозу esoдят в приточном режиме в концентрации и со скоростью. обеспечивающей потребление ее культурой, и поддержание ее остаточного содержания в культуральной жидкости, близкое к нулю. Условия культивирования

20 аналогичны таковым при выращивании инокулята.

В ходе ферментации контролируют значение рН, прирост биомассы, удельную активность -аспарагиназы, потребление кислорода и содержание сахара. После 6-9 ч ферментации биомассу Erwlnia carotovora отделяют центрифугированием для последующего выделения фермента. Получают

30 биомассу со средней удельной активностью фермента 20,4 ME/ìr сухого вещества и выходом фермента 83,6 МЕ/мл среды, Выделение фермента из клеток осуществляют одним из известных способов.

35 источника углерода 0-галактозу в количестве 0,9 — 1,1 %. Это дает возможность получить биомассу с преиндуцированными системами синтеза аспарагиназы, При пеорганизмов Государственного НИИ стан- Пример1. Посевной материал Erwinia дартизации и контроля медицинских carotovora 268 выращивают в колбах на кабиологических препаратов им. Л. A. Тарасе- чалке (220 об/мин) при 37 С в течение 18 ч вича. на среде (по 50 мл в каждой колбе) следуюКультуры хранят на мясо-пептонном 40 щего состава, ac;%: агаре (2% агара) при комнатной температу- D-галактоза 1.0 ре(18-20 С) и пересевают через каждые 3-4 Сульфат аммония 0.5 мес. Для работы используют свежепересе- Фосфорная кислота 0,35 янную 12- или 24-часовую культуру, Едкий кали 0,65

Посевной материал выращивают в кол- 45 Сульфат магния 0,02 бах на среде, содержащей D-галактозу в ка- Кукурузный экстракт 0,25 честве источника углерода в количестве Вода Остальное

0.9 — 1,1 мас,%, и глутамат натрия в качестве Выращенный посевной материал в.коисточника аминного азота в количестве личестве500млиспользуютдлязасеваино0,1%мас. Продолжительность выращива- 50 кулятора емкостью 100 л с 50 л среды ния посевного материала 16-20 ч. аналогичного состава, содержащей также

Инокулят выращивают s культиваторе О-галактозу в качестве источника углерода. емкостью 100 л с объемом культуральной Условия выращивания: аэрация 0,5 объема жидкости 50л. Для выращивания инокулята воздуха на 1 обьем среды, температура используют среду, содержащую в качестве 55 37 С, скорость. вращения мешалки 390 об/мин, продолжительность выращивания

6 ч, после чего всю культуральную жидкость из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500 л среды слеог . реходе к основной ферментации на глюкозе дующего состава, мас. : с

1713929

Сульфат аммония

Фосфорная кислота водного раствора со скоростью 12,5 л/ч. Условия культивирования аналогичны Примеру .".

После 8 ч ферментации получают биомассу с удельной активностью L-аспарагиназы 16,6 ME/мг сухого веса и выходом. фермента 84,8 МЕ/мл среды.

0,5

0,35

Едкий кали 0,65

Сульфат магния 0,02

Кукурузный экстракт 0.25

Вода Остальное рН 7,0

Условия культивирования: азрация 0,25 обьема воздуха на 1 объем среды, температура 37 С, скорость вращения мешалки 190 об./мин.

Глюкозу подают в ферментер в приточном режиме 2 ч от начала культивирования в виде 7%-ного водного раствора со скоростью 12,5 л/ч, контролируя, чтобы остаточное содержание глюкозы в культуральной жидкости было близким к нулю, Общее. количество использованной глюкозы состав5

Пример 4. Посевной материал и инокулят Erw(nla carotovora 268 выращивают в условиях, аналогичных и римеру 1. Культуральную жидкость из инокулятора передают в рабочий ферментер емкостью

1000 л с 500 л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу подают в приточном режиме в виде 10%-ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. Условия культивирования аналогичны примеру 1. После

6,5 ч ферментацию прекращают, Полученная биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью, равной 5,4 ME/мг сухого веса, и выходом фермента 35,1

МЕ/мл среды.

Пример.5. Подготовка посевного материала и инокулята Erwinia carotovora

268МЧ1 аналогична примеру 1. Подачу культуральной жидкости из инокулятора и условия культивирования в.рабочем ферментере сохраняют по примеру 1. Глюкозу подают в приточном режиме в виде 5 -ного водного раствора со скоростью 13 л/ч. После 6,5ч культивирования ферментацию прекращают. Полученная биомасса обладает удельной аспарагиназной активностью 22 МЕ/мг сухого веса, выход фермента 44,0 МЕ/мл среды.

Предлагаемый способ получения L-аспарагиназы при дробном введении глюкозы в среду обеспечивает выход биомассы с высокой удельной активностью до 21 МЕ/мг сухого вещества и съем фермента до 83,6

ME/ìë; э также сокращение продолжительности ферментации до 8-11 ч.

Формула изобретения

Способ получения L-аспарагинэзы, предусматривающий выращивание посевного материала и инокулятэ Erwinia carotovora на среде, содержащей источники углерода, аминного азота, минеральную соль и воду с последующей азробной глубинной ферментацией на среде, содержащей источник азота, минеральные соли и воду, и выделением фермента, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности фермента, выращивание посевного материала и инокулята ведут на среде, содержащей в качестве источника углерода

О-галактозу в количестве 0,9-1,1 мас.%, а ферментэцию ведут на среде, содержащей в .качестве источника углеродэ глюкозу в ляет 1 среды

После 8 ч ферментации получают. биомассу с удельной активностью L-аспарагиназы 23,0 М Е/мг сухого вещества и выходом

- фермента 87.6 МЕ/мл среды.

Пример 2, Посевной материал Erwinia

carotovora 268M12R, выращенный в условиях, аналогичных примеру 1, в количестве 500 мл используют для засева инокулятора емкостью 100 л с 50 л среды, содержащей вания инокулята аналогичны примеру 1, После 6 ч роста всю культуральную жидкость инокулята передают в рабочий ферментер емкостью 1000 л с 500л среды, содержаЩей компоненты по примеру 1. Глюкозу в ферментер подают в приточном режиме через

1,5 ч с начала культивирования в виде 7%ного водного раствора со скоростью 13 л/час. контролируя, чтобы остаточное со35

40 держание глюкозы в культуральной жидкости было близким к нулю. Условия ферментации аналогичны примеру 1.

После 6,5 ч ферментации получают биомассу Erwinia carotovora с удельной активностью (=эспарагиназы 21,8 МЕ/мг сухого вещества и выходом фермента 89,5 ME/мл среды.

Пример 3. Посевной материал Erwinia сагоючога 268М выращивают на среде и в 50 условиях, аналогичных примеру 1. 500 мл посевного материала используют для засева инокулятора емкостью 100л с 50л среды, содержащей компоненты по примеру 1; После 6 ч роста всю культуральную жидкость инокулята передают в основной ферментер емкостью 1000л с 500л среды, содержащей компоненты по примеру 1. Глюкозу начинают подавать через 2ч с начала культивирования в приточном режиме в виде 7%-ного компоненты по примеру 1. Условия выращи- 30

1713929

Составитель В;Соина

Техред M.Mîðãåí àë г

КоРРектоР О.Кравцова

Редактор H,ßöîëà

Заказ 661 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113D35, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5.

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 суммарном количестве 0,9— - 1,1 мас.$ вводимую в среду rlocne 1,5-2,0 Ч роста с концентрацией и скоростью, обеспечивающеМ поддержание ее остаточного содержания. в

8 среде, близкого к нулю, в результате Iloтребления ее культурой.в течение всего процесса ферментации, I