Способ определения верографина в растворах и биологических жидкостях

 

Изобретение касается аналитической химии,в частности определения верографина в растворах и биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа. Его ведут осаждением белка трихлоруксусной кислотой с последующим отделением осадка , кипячением надосадочной жидкости в присутствии соляной кислоты, обработкой полученного раствора сначала нитритом натрия , а затем Ы-(1)-нафтилэтилендиаминдигидробромидом и фотометрированием полученного раствора при длине волны 500 нм. Эти условия повышают специфичность анализа и его чувствительность с 3,18 до 0,05 мг. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 21/78

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 4

С)

О

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4783436/04 (22) 16.01,90 (46) 07.03.92. Бюл. ¹9 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт детских инфекций (72) Л.Н,Буловская, Г.Н,Борисенко, Г.П,Курбатова и О.А.Дробаченко (53) 543.42,063 (088,8) (56) Государственная фармакопея СССР.—

М.: Медгиз, т. 1, с. 334, 190 — 191, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОГРАФИНА В РАСТВОРАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности определения верографиИзобретение относится к биохимии, а именно к методам определения лекарственных препаратов в растворах и биологических жидкостях, и касается способа определения верографина (СПОФ А, Ч С С Р) — и роиз водного 3,5-диацетиламина-2,4,6-трийодбензойной кислоты, которое используется как диагностическое рентгеноконтрастное средство, а также для выделения отдельных типов клеток крови, в частности лимфоцитов.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности определения.

Способ осуществляется следующим образом.

0,25 мл испытуемой пробы вносят в центрифужную пробирку с 0,5 мл дистиллированной воды (если предполагают высокую концентрацию вещества, то разводят в... Ы, „1718060 А1 на в растворах и биологических жидкостях.

Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности анализа. Его ведут осаждением белка трихлоруксусной кислотой с последующим отделением осадка, кипячением надосадочной жидкости в присутствии соляной кислоты, обработкой полученного раствора сначала нитритом натрия, а затем N-(1)-нафтилэтилендиаминдигидробромидом и фотометрированием полученного раствора при длине волны 500 нм, Эти условия повышают специфичность анализа и его чувствительность с 3,18 до

0,05 мг. 4 табл. большей степени), добавляют 0,25 мл 20% трихлоруксусной (ТХУ) кислоты, если образуется осадок центрифугируют и отсасывают

0,5 мл центрифугата, который подкисляют

0,1 мл 4н. HCI, закрывают фольгой и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение

60 мин, затем охлаждают в холодильнике при 4 С 30 мин, приливают 0,1 мл

0,2% свежеприготовленного NaNOz, через 4 мин — 0,1 мл 1% аммония сульфаминовокислого, через 2 мин — 0,2 мл 0,01% и-(1)-нафтилзтилендиаминдигидробромида (Н ЭД).

Пробы оставляют стоять в темноте в течение 30 мин. После каждого прибавления реагентов и при оставлении в темноте пробы встряхивают для развития окраски. 3атем фотометрируют на МКМФ в кювете объемом 1 см при толщине слоя 1 см и длине волны 500 нм.

1718060

Таблица 1

Без гид олиза

Гид олиз

Э кстинкция

Еьоо нм

0,000

0,000

0,000

0,000

0,000

Разведенная плазма крови после Морские свинки выделения лимфоцитов с использованием верографина

0,100

0,130

0,240

0,457

0,030

Петухи

1,43 г/1

3,58 г/1

Раствор с концентрацией

Пример 1, 0,25 мл раствора, содержащего около 100 мкг верографина приливают в центрифужную пробирку с 0,5 мл дистиллированной воды, затем добавляют

0,25 мл 20% ТХУ, перемешивают и центрифугируют. Отсасывают 0,5 супернатанта в обычную пробирку, приливают 0,1 мл 4 н.

HCI, закрывают фольгой и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 60 мин, охлаждают в холодильнике 30 мин, приливают 0,1 мл 0,2% свежеприготовленного нитрита натрия, через 4 мин — 0,1 мл 1% аммония сульфаминово кислого (АМС), через 2 мин — 0,2 мл 0,01% НЭД. Пробы оставляют в темноте на 30 мин, периодически встряхивают. Через 30 мин фотометрируют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500 нм.

Пример 2, 0,25 мл сыворотки вносят в центрифужную пробирку с 0,05 мл дистиллированной воды, добавляют 0,25 мл 20%

ТХУ, центрифугируют, отсасывают 0,5 супернатанта и обрабатывают как указано в примере 1.

Пример 3. 0,25 мл мочи, разведенной в 5 раз, вносят в центрифужную пробирку с

0,5 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют. Отсасывают 0,5 супернатанта и обрабатывают как указано в примере 1.

Пробы, содержащие верографин

В табл.1 представлены данные, полученные при определении верографина способом нитрования без гидролиза и с гидролизом, 5 В табл.2 представлены данные, подтвер>кдающие влияние времени гидролиза на определение верографина; в табл.3— спектры поглощения света азопроизводным верографина; в табл.4 — данные, пока10 зывающие влияние времени азосочетания на изменение оптической плотности раствора, Данный способ позволяет повысить специфичность определения и чувствитель15 ность до 0,05 мг, т,е. в 63,6 раза по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

Способ определения верографина в

20 растворах и биологических жидкостях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой, от„еления осадка, обработки надосадочной жидкости нитритом натрия, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения

25 чувствительности и специфичности определения, перед обработкой нитритом натрия надосадочную жидкость кипятят в присутствии соляной кислоты, полученный раствор обрабатывают N-(1)-нафтилэтилендиамин30 дигидробромидом и фотометрируют при длине волны 500 нм.

1718060

1 !

I

I

I

I

1

1

1

r1

1

I

I

1

1

1

1 сч

Cg 1

I 1, I

S I

I с

>о I

Ф I

1! 1

1

1 о

/

1:5

lu о х

>r о

Y о

Ф

1

1 !

I !

1

1

1

I

I

1

1

1

1

1

1..

1

1

1

I

1

I!.. о

Cg

S

S с

Э

CZC о

Ф

lo

Ф у

S с о о м

z

1 S

1Ф

lZ

1

I Э

I S

1Z

ГЦ

1 3

I Э

1

I S

1 CL

IC:

I !

> .о

z л с

X о х о

CD

1

1 1

1 Щ

1

1

1

I !

1

I

1

1

1

1

1

1

I

I

1

1

1

1

1

1

I

1 !

I

1

1 !

1 Q

1 О

1 С»

1 «

I т а

1 C

1 Ф

1 S с о

1 O.

1 Е»

1 S

1 !

I

1

1

1

1 !

1

1

Cg 1

S X

Я} л

Ф Э

CL lO о о а а с

Ш Ф

CQ

O.

О а

Ф

mo а

O C1I

2 z

l- S о О м - o с> ооо

° л ооо

-&+I +!

СО О Глл

LA 0 Ъ (4 о о сч л л л ооо сч мо л O л ооо

° л л оîо

4.(б! +1 мr м

4А О> О

o o

° л ° о о о

«счв ооо о с» о л °

ООО

+) с4 44 милчо м Ом о о л л

ООО

CV -о о с» ооо л л л

ООС

+! 4-l +!

М1В сЧ мО

О О О

° л л ооо м ооо о о о

° л л о о о

+ +!+1

IO О

- м О о о о л о о о о Олооо ооо л

D D D

+I +I 4-1

LA О>

О I (1 ооо ооо

O D ооо

LrC л (4 л- (4 -4 л оо о

1 I

1О

1а

1О

I S

1а

1С

1 !»;

1О

11

1 Э

1 CU

1 Г

1 Э

IX

1 I! о

IS

1!»

1О о

I X

I S

1О

I S

I m

1 Cg

1 6)

1>r ! о

1Z

1Z

I Q

1 111

1 l1О

I Ф

1 З

1 S ! с

1О

1М

I X

IQ

1S

IZ

1Э

1Z

1 Ф

1 O.

1Х

1О

1О

I LI

1 CC

1 Я

1 Б

1 С

1О

I а

1 Ct

IS

1 1.

1 Cg

1 lIO

1Z

1С о

1 С

1 CL

1 Щ

1Э

1 .й

1С

lOo

IIO O см О

С4 л

СГ\

С4

Г< сч

Г4

1-л

CD сГ\

CD л

О О о

° О

CD

LA

CD

LA

Ю л

Ю

Ю сГ\!

Д

rg o х lv o э о

i r

S Iо с с= о с

1 1 м !

1 I

1 1 с!! I 1

I 1

=Т1 1

1 1

1 I

1 1 с !

1 I сс) 1 1

Я I I

1 LA 1 а

1 . 1

I 1

1 1

1 1

1 I

1 О1 !

1 !

1 . 1

1 I

1 1

1 1

I LA 1

1 СО 1

I - 1

I I! 1

1 I

1 1

1 О 1

1 CO 1

1 - ф I

I . !

1 1

1 1

l 1

1 О 1! !

1 - Х !

1 !

1 1

1 1

1 1

1 О 1

1 О 1! -4 1

1 1

l" I

1 1

1 1

1 Ю I

1 lA 1

1 - Ф 1

1 1

1 1

I 1! 1

1 CD I

1 I

1 =! 1

1 1

I 1

I I

1 !

О м

1 -4 1

1 I

1 1

1 1

1 Ю 1

1 с«4 1

1 - I

I I

1 !

1 I

I 1

1 О 1

I.л 1

1 - 3 I

1 I

1 1

1 1

1 1

I Ю 1

l Ю 1! - I

1 1

I 1

1 I

1 I

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 1

1 Д 1

z! I

1 I! !

1718060

О

LA

C«I CD

OO

CD Ю! л

-3

CV CD л Ъ, )

О Ln с:! (" \ л О м о а

1

1

1

I м

-3 1

О 1

О 1

1 с<

О I л

1 л 1 сГ\ 1

С? 1

Ю 1

1 с,С! 1

Ю i

° 1

О 1

1 м

О 1

О 1

1 л 1 с ! ч 1

Ю 1

1 с!

LA I °

«1

CD I

1 CD

С 3 1

1 S л Q.

CD С

1 К. сГ\ 1 S т 1 Z е4 1 О

1 И

С О

I !

О 0 с

CV 1

CD 1 О

1 S сЧ O сГ1 Y с I сС!! «Е

1 °

1 Э

-4 1 .О 1 S

С4 1 л Д

О 1

1 Ш

I С!!

IU Л 1!

o o эо!

z x с:

1- о

o c

1718060

Таблица 4

Проба

Количество верографина

s пробе (икг) 15 мин

45 мин 60 мин

Раствор верогра" фина 100

0,116+0,001 0,115+0,000

0,115+0,000

0,115 0,000

0,010+0,006 0,012+0,002

0,007+0,004

0,010+0,000

0,135+0,000 0,138+0,003

100

0>130" 0,000

Сыворотка без верографина

;контроль) 0,196+0,029 0,197+0,028 0,200+0,025

100

0,099>0 000 0,05+0,000 0,103+0,00!

0,095 0,000

П р и м е v а н и е. Окраска полностью развивается через 30 мин, в дальнейшее время не происходит достоверного увеличения оптической плотности.

40

50

Редактор О.Хрипта

Заказ 874 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж -35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Н20 дистиллиро" ванная(контроль)

Сыворотка, содержащая верографин

Ноча (1:5), содержащая верографин моча (1:5) без верографина (контроль) Оптическая плотность при гидролиэе в течение т

30 мин

О 01 5+0 ю 000 Оэ 020+0 ° 000 Îэ 025+Îю 000 О э 025+0 ° 000

Составитель С.Хованская

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Т.Малец