Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus.мusсulus l.-продуцент моноклонального антитела к глутаматным рецепторам мозга человека
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для обнаружения глутаматных рецепторов мозга человека. Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (МонАт) к глутаматным рецепторам мозга человека. Штамм получен на основе клеток иммунной селезенки мыши линии BALB/C и клеток мышиной миеломной линии Х-63-Ад-653. МонАт принадлежит к субклассу 1д 61. Штамм депонирован под № ВСКК(П) 363 Д. Клетки штамма культивируют в стандартных условиях на среде с 20% сыворотки, а также в виде асцитной опухоли в сингенных мышах . Изучение взаимодействия МонАт с нейрорецепторами глутамата методом иммуноферментного анализа выявило высокую специфичность, и возможность применения данного антитела для выявления иммобилизованных глутаматных рецепторов с помощью иммуноферментного метода. Связывание МонАт, продуцируемого штаммом A-HGR-7C5, с глутаматными рецепторами на срезах посмертных препаратов коры головного мозга человека показало, что оно получено и пригодно для сравнительного анализа распределения нейрорецепторов глутамата в норме и при патологии центральной нервной системы. И
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4764873/13 (22) 06Л 2.89 (46) 23.03.92. Бюл. й. 11 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР и Институт эксперимен.тальной медицины АМН СССР (72) С.А. Дамбинова (53) 578.085.23(088. 8) (56) Дамбинова С.А., Смирнова Т.M., Маргулис M.Н., Огурцов P.Ï. Биохимия, 1987, т.52, вы п.9, 1523-1530. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS
MUSC0LUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛО-НАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ГЛУТАМАТНЫМ
РЕЦЕПТОРАМ МОЗГА-ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для обнаружения глутаматных рецепторов мозга человека. Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (МонАт) к глутаматным рецепторам мозга человека, Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для .выявления антигена — глутаматных рецепторов мозга человека.
Цель изобретения — получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело к глутаматным рецепторам мозга человека, пригодное для выявления этих рецепторов, изучения их структуры и функционирования..
Штамм гибридомы А-HGR 7C5 ВСКК(П)
М363Д получают следующим образом.
Мышей линии BALB/С иммунизируют внутрибрюшинно введением 50 мкг глутаматсвязывающих мембранных белков, вы„„ Ы „„1721089 À1
Штамм получен на основе клеток иммунной селезенки мыши линии BALB/С и клеток мышиной миеломной линии Х-63-Ag-653.
МонАт принадлежит к субклассу Ig 61.
Штамм депонирован под М ВСКК(П) 363 Д, Клетки штамма культивируют в стандартных условиях на среде с 20 сыворотки, а также в виде асцитной опухоли в сингенных мышах. Изучение взаимодействия МонАт с нейрорецепторами глутамата методом иммуноферментного анализа выявило высокую специфичность и возможность применения данного антитела для выявления иммобилизованных глутаматных рецепторов с помощью иммуноферментного метода. Связывание МонАт, продуцируемого штаммом A-HGR-7C5, с глутаматными рецепторами на срезах посмертных препаратов коры головного мозга человека показало, что Оно получено и пригодно для сравнительного анализа распределения нейрорецепторов глутамата в норме и при патологии центральной нервной системы.
Ы аеЪ деленных из посмертных препаратов коры головнОго мозга человека и идентифицированных в экспериментах радиолигандного связывания с (Н)-L-глутаматом как рецеп Ф торы глутамата, в полном адьюванте Фрейнда. Параллельно антиген вводят в количестве 25 мкг в хвостовую вену. Через
7 дней иммунизацию повторяют без адъюванта. Через 7 дн. после этого мышей, сыворотка которых имеет титр 15000 (титр определяют методом иммуноферментного анализа), иммуниэируют в течение 3 дн, вводя 25 мкг антигена в хвостовую вену ежедневно, По прошествии этого времени
12х10 клеток селезенки иммунных мышей
1721089 гибридизуют с 25х10 клеток миеломы, мыши Х63.Ag8,653 в присутствии среды
RPMI 1640, содержащей 45 (об./об.) полиэтиленгликоля (мол.м. 3350) и 15 диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 2х10 кле5 ток в лунку. Для культивирования и селекции гибридных клеток используют среду RPMI 1640 с добавлением 10% nomaдиной сыворотки и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, -4
4х10 M аминоптеринаи 1,6х10 Мтимидина.
Гибриды-продуценты клонируют методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку планшета, содержащую 4х10 кле-.
4 ток селезенки в качестве фидерного слоя.
После второго клонирования практически
100% субклонов продуцируют антитела к глутаматным рецепторам мозга человека.
Продукция антител сохраняется как минимум в течение 28 пассажей в культуре.
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Среда для культивирования — RPMI
1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ 1-глутамина. 10 мМ пирувата
Na, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот и витаминов для базал ьн ой среды Игла, 0,05 м М меркаптоэтанола, Культивирование проводят при
37 С в атмосфере 5 углекислоты.
Посевная доза 10 клеток/мл. Через 3-4
5 дн концентрация антител в культуральной среде достигает 10-20 мкг/мл. Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гибридомные клетки морозят в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания; 4 С/мин до 4 С, затем 1 /мин до-70 С. после чего клетки переносят в жидкий азот, Клетки размораживают, перенося ампулы из жидкого азота в водяную баню при 37 С.
Для выращивания гибридомного штам.ма в асцитной форме клетки вводят внутрибрюшинно мышам линии ВА1 В/с, обработанных пристаном, в количестве
4х10 клеток на мышь, Асцит созревает через 12-14 дн.
Гибридома условно названа А-HGR7С5. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом А-HGR-7С5, относится к изотипу IgG, подкласс 61 и связывает надмембранный участок глутаматных рецепторов мозга человека.
Специфичность взаимодействия антител с нейрорецепторами L-глутамата выявляют с помощью иммуноферментного и иммуногистохимического анализов.
Для получения препарата моноклональных антител в количестве. необходимом для проведения иммунохимических исследований, гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5х10
2 5 клеток в 5 мл среды RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% nomaдиной сыворотки, 4 мМ глутамина, 10 мМ
10 пирувата Na, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3 — 4 дн при
37 С в атмосфере, содержащей 5% углекислоты, Культуральную среду. собирают центрифугированием в течение 10 мин при 800g, Полученный еупернатант используют для выявления специфичности. взаимодействия антитела с глутаматными рецепторами мозга человека.
Определение . специфичности взаимодействия моноклонального антитела с анти15
20 геном иммуноферментным анализом.
На полистироловый 96-ячеечный план100 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН
9,6) при 4 С в течение ночи, После насыщения планшета 0,05%-ным раствором Твин-, 20 в фосфат но-сол евам буфе ре (5м М
NaH2PO4, 140 MM NaCI, рН 7,4) для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком (1 ч, 20 С), в ячейки вносят
100 мкл культуральной среды штамма AHGR-7С5 (1 ч, 20 С). Затем планшет промывают 4 раза фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% ный Твин-20, и вносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (2 мкгlмл, 1 ч, 20 С). После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным выше
40 способом, а связавшийся конъюгат определяют по расщеплению субстрата пероксидазы (HzOz} в присутствии хромогена— ортофенилендиамина. Положительная реак45 ция характеризуется развитием коричневой окраски, интенсивность которой измеряют по поглощению при 492 нм. В качестве контрольныа анмгенов используют глутаматутилизирующие ферменты: глутаматдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу.
Результаты показывают, что антитела эффективно связываются с глутаматными рецепторами мозга человека и не взаИмодействуют с контрольными антигенами.
Определение специфичности моноклонального антигена иммуногистохимическим анализом.
Для этого исследования используют срезы посмертных препаратов коры голо50
25 шет сорбируют антиген — 1 мкг на ячейку в
1721089
Составитель Е,Орлова
Техред M,Ìîðãåíòàë
Редактор В.Петраш
Корректор Л.Патай
Заказ 928 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вного мозга человека. Полученные при аутопсии (не позднее 1 ч после смерти) образцы коры помещают в жидкий азот и используют для приготовления срезов (5 мкм).
Для фиксации срезов используют 10 -ный раствор формалина в фосфатно-солевом буфере. Фиксацию проводят в течение 10 мин при 20 С. Срезы отмывают,в течение 1 ч фосфатно-солевым буфером и наносят моноклональные антитела (культуральную среду) с добавлением 107; человеческой сыворотки (инкубация 30 мин, 20 С), После промывки фосфатно-солевым буфером (10 мин, 20 С) наносят кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши с 10 человеческой сыворотки. Срезы отмывают как описано выше и инкубируют с культуральной средой, содержащей моноклональные антитела. против пероксидазы и перокеидазу (30 мин, 20 С), отмывают снова, реакцию проявляют с помощью субстрата -диаминобензидина в трис-НС! буфере (50 мМ трис, 150 мМ NaCI, рН 7,5) в присутствии Н О, Моноклональное антитело выявляет интенсивно окрашенные тела нейронов, нейро-. пиль, осевые цилиндры миелинизированных и немиелинизированных волокон с помощью светового микроскопа. Для определения специфики окрашивания срезы прединкубируют с L-глутаматом (100 мкм) в трис-цитратном буфере (50 MM трис, 10 мМ СаС!г, рН 72) в течение 30 мин при 37 С. Дальнейшую обработку. срезов проводят как описано выше.
Предварительная обработка срезов L-глутаматом приводит к значительному сниже5 нию. а в некоторых случаях к исчезновению окраски.
В качестве контроля в этих экспериментах используют моноклональные антитела к эндотоксину грамотрицательных бактерий
10 (!g класса М) и антитела к коллагену II-(Ig класса G). С помощью этих антител не выявляют никаких структур нервной ткани.
Эти результаты свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального ан15 титела А-HGR-7 С5, возможности применения этого антитела в качестве маркера для выявления глутаматных рецепторов и их распределения на срезах мозга человека в норме и при различной патоло20 гии центральной нервной системы с помощью иммуноферментного метода, а в перспективе и получения чистых препаратов глутаматных рецепторов на колонках с иммобилизованными антителами.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus .
ВСКК(П)Й363Д вЂ” продуцент моноклональ30 ного антитела к глутаматным рецепторам мозга человека,
