Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к теофиллину
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином. Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных коньюгированным антигеном теофиллина с гемоцианином, с клетками миеломной линии Р3 - Х63. AG 8653. Клетки характеризуются свойствами, типичными для гибридом. Продуктивность штамма - 5 - 8 мг/мл монАТ в асцитической жидкости. МонАТ специфичны для теофиллина и относятся к классу IGG2a. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 367Д. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4729105/13 (22) 09.08.89 (46) 30.08,91, Бюл, М 32 0 3 (Я О (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт "Биотехнология" (72) P.Ã. Василов и Н.П. Данилова (53) 578.085.23 (088,8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫX МU. MUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТЕОФИЛЛИНУ Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином. Штамм получают следующим образом. Клетки мышиной миеломной линии Х63 Ag 8653 гибридизуют со соленоцитами мыши линии Balb/c, иммуниэируют коньюгированным антигеном теофиллина с гемоцианином. Мышей иммуниэируют 3-4 мес, периодически сыворотку животных анализируют на присутствие антител к теофиллину, Анализ осуществляют твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена используют конъюгированный антиген теофиллина с человеческим сывороточным альбумином. У животных с высоким титром антител к теофиллину берут селезенку и выделяют иэ нее клетки для слияния, Миеломную линию X63, Ag 8653 (стабильную миеломную линию, не секретирующую им„„50„„1673597 А1 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для лекарственного мониторинга при терапии теофиллином. Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных конъюгированным антигеном теофиллина с гемоцианином, с клетками миеломной линии РЗ-Х63. Ag 8653. Клетки характеризуются свойствами, типичными для гибридов. Продуктивность штамма — 5-8 мг/мл МонАТ в асцитической жидкости. МонАТ специфичны для теофиллина и относятся к классу IgG2a. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) Nã 3670. 1 табл. муноглобулины) выбирают в качестве второго партнера для слияния. Слияние клеток проводят с использованием полиэтиленгликоля, Отношение числа селезеночных клеток к числу миеломных клеток варьируют от 5:1 до 1:1. После слияния клетки разбавляют и культивируют в селективной среде, содержащей аминоптерин, гипоксантин и тимидин, до появления растущих клонов, Супернатанты анализируют твердофаэным иммуноферментным методом, в качестве антигена используют коньюгат теофиллина с человеческим сывороточным альбумином, антитела обнаруживают с помощью кроличьих антител к IgG мыши, меченных пероксидаэой хрена, так что выявляются только клоны, продуцирующие антитела класса G. Дополнительный анализ синтеэируемых антител производят по ингибированию тиофиллином и его аналогом связывания антител с сорбированным конъюгатом теофил1673597 50 лин — человеческий сывороточный альбумин, Положительные клоны повторно клонируют. Из положительнгых клонов выбирают клон 2G34, продуцирующий антитела с минимальной перекрестной реактивностью по отношению к метаболитам и аналогам теофиллина. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 367Д, Клон продуцирует антитела, относящиеся к подклассу IgG2a. Для получения больших количествантител гибридные клетки вводят внутрибрюшинно мышам, предварительно сенсибилизированным пристаном. Антитела из асцитных жидкостей ионообменной хроматографией на ДЕАŠ— целлюлозе. Полученные моноклональные антитела используют в иммуноферментном методе определения теофиллина. Штамм характеризуется следующими признаками, Культуральные свойства клона 2G34 типичны для гибридом. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5-10 клеток/мл, время субкультивирования составляет около48ч, Продуктивность штамма. Штамм продуцирует специфичные к теофиллину монАТ с концентрацией 5 — 8 мг/мл в асцитической жидкости. Криоконсервирование. Криоконсервирование гибридомыгосуществляют в смеси равных объемов среды RPM11640 и телячьей эмбриональной сыворотки, содержащей 15 диметилсульфоксида, по 10 клеток в ампуле. Первые 3 суток ампулы хранят при -70 С, затем переносят в жидкий азот. После разглаживания не теряют своих ростовых свойств. Характеристика моноклональных антител. Антитела из асцитоа выделяют солевым осаждением сульфатом аммония и последующей хроматографией на ДЭАЭ вЂ” целлюлозе с использованием градиента 0,01 М фосфатного буфера, рМ 7,2, 0 — 0,5 V NaCI. Гомогенность выделенных антител прове5 40 ряют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Антитела, синтиезируемые клоном 2G34, относятся к подклассу 62э, что определено твердофазным иммуноферментным методом с использованием козьих антител, к подклассам мышиного имму оглобулина 6, меченных пероксидазой. Пример, Использование полученных моноклональных антител для иммуноферментного определения теофиллина в сыворотках крови. Коньюгированный антиген тео-г/э-ЧСА растворяют в 0,05М натрий карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96 — луночных планшетах фирмы NUNK no 100 мкл на лунку при 4 С в течение ночи. затем твердую фазу отмывают 0,05 -ным раствором тритона Х-100 3 раза и 3 раза водой. Аликвоты по 3 мкл из cblBopoTQK крови больных, получавших теофиллин, или лошадиной сыворотки, содержащие известное количество препарата, вносят в лунки планшета и добавляют по 100 мкл Ig — PO в 0,01 M натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCI, 0,05Я, твин — 20 и 0,2 БСА, концентрации 1,1 мг/мл, разведение 1:800. Смесь тщательно встряхивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, твердую фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 30 )(, ного Н202 и 4 мг ортофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрийцитратного буфера, рН 5,0), инкубируют 10 мин в темноте, детекция при 492 нм, Специфичность антител, продуцируемых клоном 2634., к теофиллину представлена в таблице, Таким образом, использование монАТ позволит осуществлят контроль за концентрацией препарата в организме больного, индивидуальный подсор дозы теофиллина для лечения, Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Vus. musculus I „ВСКК(П) hk 367Д, испольэуемыи для получения моноклональныx антител к теофиллину, 1673597 Составитель А.Маныкин Редактор Л,Веселовская Техред М.Моргентал Корректор М.Кучерявая Заказ 2896 Тираж 361 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
