Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к миоглобину человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение штамма гибридныхклеток , продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к непеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамм МГ,806.А2.Р7 (далее обозначается 8D6)хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под № ВСКК(П)221Д. рекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамгч получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c клетками миеломы Х63-Ад.8.653. Штамм получил название 8D6 и/ депонирован под номером ВСКК(П) № 221Д, Клетки штамма культивируют на среде 1 М с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки монАТ, продуцируемые штаммом 8D6, относятся к кляссу igG1. имеют константу связывания 6,25x10 М и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина. Культуральные свойства штамма ипичны для гибридом, продуктивность в титрах антител 10 в культуральной жидкости и 10 в асцитической. МонАТ не теряют способности к связыванию с миоглобином после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двухсайтных флуороиммунометрических системемах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BAL В/с иммунизируют раствором очищенного Мч. Первые иньек-1 ции Мч проводят в сочетании с полным и неполным адъювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию инъекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спленоцитов с клетками плазмоцитомы P3.X63-Ag8.653 проводят в присутствии 40% полиэтиленгликоля (мол. м. 1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду 1М добавляют гипоксантина, аминоптерина, 1,6-10 М тимидина. Наиболее продуктивные знтителопродуцируюО 00 Ю со 00 Ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВEННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

h (21) 4729982/13 . (22) 16.08.89 (46) 07.10.91. Бюл. № 37 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР, Институт клинической иммунологииСОАМН СССРи Кооператив" Биос" (72) П.П.Лактионов, M.Â.HåöàåBà, В.В.Рошке и Е.Ю.Рыкова (53) 578.085,23(088.8) (56) Hurrell Т.R. et aI J. Immunol Meth, 1981, ч.45, № 3, р. 249-254. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМ ЫХ КЛ ЕТОК ЖИ ВОТН ЫХ MUS.

MIJSCULUSl= ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МИОГЛОБИНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть испоаьзовано для количественного определения миоглобина человека в сыворотке крови, Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к непеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина человека в сыворотке крови, Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека.

Штамм МГ,8DG.А2.F7 (далее обозначается 8DG) хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH

СССР под № ВСКК(П)221Д.

„„5U „„1682389А1 (я) С 12 и 5/18, С 12 Р 21/08 рекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамм получаю гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей ВА В/с клетками миеломы Х63 — Ag.8.653, Штамм получил название 8D6 и депонирован под номером ВСКК(П) ¹ 221Д, Клетки штамма культивируют на среде 1 M с добавлением

10% эмбриональной телячьей сыворотки монАТ, продуцируемые штаммом 8D6, относятся к классу 1 81 имеют константу связывания 6,25х10 M и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина. Культуральные свойства штамма типичны для гибридом, продуктивность в титрах антител 10 " в культуральной жидкости и 10 в асцитической. МонАТ не теряют спосооности к связыванию с миоглобином после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двухсайтных флуороиммунометрических системемах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BAL В/с иммуниэируют раствором очищенного Мч. Первые иньек ции Мч проводят в сочетании с полным и неполным адьювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию иньекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спленоцитов с клетками плазмоцитомы

РЗ,Х63-Ag8.653 проводят в присутствии

40% полиэтиленгликоля (мол. м. 1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду

1Мдобавляют104М гипоксантина,410 М аминоптерина, 1,6 10 М тимидина, Наибо-Б лее продуктивные антителоп родуцирую1682389 щие клоны выделяют по результатам пятенного иммуноферментного анализа (ИФА) и радиоиммуноанализа (РИА) и обозначают

8D6, Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура штамма состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток примерно одинаковой величины с крупными ядрами.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования — 1М или

DMEM c добавлением 10 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина.

Клетки культивируют при 37 С в атмосфере

4-6 СО . Посевная доза 0,2 10 кл/мл, клетки пассируют 1 раз в 2 — 3 дня, кратность рассева 1:5 (из плотности 10 кл/мл). Культура полусуспензионная, выращивается в пластиковых культуральных флаконах.

Штамм продуцирует антитела на протяжении как минимум 50 пассажей в культуре.

Для выращивания штамма в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей линии BALB/ñ в количестве 10

7 кл/на мышь; за 10 — 15 дней до прививания клеток мышь сенсибилиэируют введением

0,5 мл пристана внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10- 15 дней. Асцитную жидкость забирают 2-5 раз через 1-2 дня.

Общий выход асцитной жидкости 10 — 15 мл/на мышь. Штамм перевивается с эффективностью не менее 80 .

Продуктивность штамма. Титр антител в культуральной жидкости 10 сохраняется неизменным на протяжении 50 клеточных генераций. Титр антител в асцитной жидкости 10 сохраняется неизменным на протяжении 4-х пассажей, Характеристика полезного продукта.

Штамм синтезирует монАТ класса lgG1.

Константа диссоциации иммунного комплекса составляет 6,25 10 М, МонАТ сохраняют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.

Криоконсервирование. Клетки замораживают на криопро1.екторной среде, содержащей, $: 1M 0МЕМ 60; эмбриональная телячья сыворотка 7; сыворотка крупного рогатого скота 23; диметилсульфоксид 10.

Ампулы помещают в пенополистирольную закрытую коробку толщиной стенок 1 см, оставляют при -70 С на 20 ч, затем перено35

50 ют в растворе 002 желатина в буфере

TBS (0,02 М трис-НС1, рН 7,5, 0,15 М NaCI).

Обработанные таким образом фильтры разносят по лункам 96-ячеечного планшета и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре с 50 мкл супернатантов культуральной среды в разведениях от 1:10 до

1:10 . После инкубации фильтры отмывают

3 раза в TBS и вносят по 50 мкл конъюгата антител козы против lgG мыши с пероксидазой хрена. После инкубирования в течение

1 ч при комнатной температуре фильтры отмывают 3 раза в TBS и связавшуюся пероксидазу и антитела против Мч детектируют по расщеплению субстрата (НгОг) в присутствии хромогена 4-хлор-1-нафтола. Наличие антител определяют по степени антенсивности окрашивания пятен фиолетового цвета. Для дальнейшей работы отбирают только высокопродуктивные и специфичные клоны по наиболее интенсивно окрашенным пятнам.

Пример 2. Анализ неперекрываемости эпитопов связывания монАТ штамма 404 с Мч.

Клетки штамма помещают в пластиковые флаконы с площадью дна 75 см в колисят в жидкий азот. Размораживают клетки в термостате при 37 С, Жизнеспособность клеток после размораживания составляет

5 Пример 1. Получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши

Mvs,MuscuIus, продуцирующего монАТ к Мч, Мышам линии ВА1 В/с вводят 100 мкл

10 раствора Мч в концентрации 0,5 мг/мл в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда. С интервалом в 3 недели проводят еще 2 инъекции в неполном адъюванте Фрейнда. За 4 дня до гибридизации вводят 100 мкг Мч в 200

15 мкл физиологического раствора внутривенно; В следующие 2 дия повторяют инъекции внутрибрюшинно. Клетки селезенки иммунизированной таким образом мыши (10 клеток ) объединяют с клетками мирло20 мы мыши Х63-Ag 8.653 (5 10 клеток) в присутствии 1 мл 40;(, полиэтиленгликоля (Т}ЭГ) мол, м. 1000. После добавления ПЗГ реакционную смесь центрифугируют 3 мин, 200

g, супернатант сливают, клетки ресуспенди25 руют в 6 мл среды 1М, содержащей 107

3 T C 1 0 4 г и и о к с а н т и н а, 4 ° 1 0 7 M а м и ноптерина и 1,6 10 М тимидина. Гибридпродуцент отбирают с помощью пятенного

ИФА супернатантов культур. Для этого на

30 нитроцеллюлозные фильтры (диаметр пор

0,45 мкм) размером 4х4 мм с помощью микрошприца наносят 10 нг очищенного Мч в объеме 0,1 мкл. Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубиру1682389

55 честве 3 10 в 20 мл среды 1М с 10;(, ЭТС, 100 мкг/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют 3 — 4 дня при 37 С в атмосфере 5 СОг. Культуральную среду вместе с клетками собирают, центрифугируют 10 мин при 800g, клетки отмывают один раз средой 1М без сыворотки и вводят в количестве 10 кл/мл внутрибрюшинно мышам линии BAL B/с, сенсибилизированным за 7 — 10дней пристаном. Из полученных асцитных жидкостей выделяют монАТ осаждением насыщенным раствором сульфата аммония (1 ч при 4 С).

После центрифугирования (30 мин, 2000g, 0 С) осадок диализуют против буфера 0,025

М Na-фосфат, рН 7,5, 0,15 М NaCI, 0,05 йайОз в течение 2 сут. затем проводят гельфильтрацию на колонке с сефакрилом S—

300 (обьем колонки 500 мл), буфер элюции

0,0125 М Na-фосфат, рН 8,4, 0,15 M NaCI, 0,05 йайОз. Выход пика иммуноглобулина контролируют по оптической плотности, степень очистки определяют по электрофорезу в полиакриламидном геле.

Очищенные монАТ клона 404 сорбируют на поверхности полистирольных пробирок из раствора с концентрацией 0,2 мгlмл в 0,01 M трис/НС1, рН 7,5, 0,1 M NaCI. В каждую пробирку наливают 400 мкл раствора монАТ и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, остаточные центры сорбции блокируют 0,01 М трис/Н Cl, рН 7,7, 0,14 М NaCI, 10 бычья сыворотка, 0,027 твин-20. 0,05 йайОз. Для определения перекрываемости эпитопов связывания монАТ в -.пробирки в иммобилизованными актителами клона 404 вносят Мч, меченый I (36,5 мкг Мч на пробу) и антитела того же штамма в разных концентрациях. Все растворы монАТ готовят на буфере, в котором проводят блокировку. После добавления монАТ пробирки инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем жидкую фазу оттягивают, а количество связанного

Мч определяют по излучению 1 на счетчике, время счета 1 мин.

Проведенный опыт показывает, что при внесении антител штамма 404 наблюдается уменьшение связывания Мч с монАТ, иммобилиэованными на пробирке, Это свидетельствует о том, что манАТ, продуцируемые штаммом 404, взаимодействуют с двумя неперекрывающимися эпитопами молекулы Мч.

Пример 3. Использование монАТ штамма 404 в двухсайтном флуороиммунометрическом анализе на Мч;

МонАТ очищают из асцитных жидкостей, как описано в примере 2, сорбируют

50 нэ полистирольных пробирках. В качестве

"проявляющих" антител используют монАТ штамма 806, предварительно меченных Fu следующим образом. 2,5 мг очищеннных монАТ штамма 806 растворяют в 0,5 мл 0,1 M

Na-фосфатного буфера, рН 9,0 и добавляют изотиоцианатофенилкомплексонэт европия (150-кратный молярный избыток), инкубируют 12 — 18 ч при 4 С. От несвязавшегося реагента освобождаются гель-фильтрацией на колонке с ультрагелем АсА34, размеры колонки: 1х27 см. буфер элюции 0,05 М трис — HCt, 0.15 M NaCI, 0,05 йайОз, рН 7,5 (TBS). B пробирки с иммобилизованными монАТ штамма 404 вносят no ": мкг меченных Еи монАТ ш гамма 806 в 350 мкл TBS, содержащего 0,027, твин — 20 и 10 бычьей

cblBopGTKH, Затем с интервалом 15 с вносят по 50 мкл разведений сывороток или соответствующих стандартов Мч. После инкубирования в течение 15 мин при комнатной температуре жидкую фазу отсасывают при помощи водоструйного насоса и добавляют в каждую пробирку по 400 мкл TBS, содержащего 0.02 твин-20 для отмывки.

Процедуру отмывки повторяют 3 раза, в отмытые пробирки добавляют по 400 мкл усиливающего рас вора, выдерживают по

10 мин на встряхивателе и измеряют интенсивность флуоресценции на время-разрешенном флуориметре, Результаты анализа показывают, что даже при значительном разведении контрольной сыворотки (в 256 раз) получают достоверный сигнал. Это свидетельствует о том, что метод двухсайтной время-разрешенной флуороиммунометрии позволяет определятьуровень Мч в диапазоне концентраций от 2 до 1000 нг/мл. Аналогичный метод с использованием радионуклидэ 1 характеризуется меньшей чувствительностью — минимальная концентрация Мч в пробе 10 — 15 нг/мл. Кроме высокой чувствительности, следует отметить быстроту метода 30 мин (в случае РИА около 1 ч), что крайне важно для экспресс-диагностики инфаркта миокарда.

Таким образом штамм 404, продуцирующий монАТ к Мч, может быть использованв двухсайтном флуороиммунометрическом анализе и обеспечивэетповышение чувствительности метода в 5 раз по сравнению с известными методами и сокращение времени анализа до 30 мин.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.Musculus L, ВСКК(П)

1Ф 221Д вЂ” продуцент моноклональных антител к миоглобину человека