Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к миоглобину человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина в сыворотке крови человека. Целью изобретения является получение штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к неперекрещивающимся Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике для количественного определения миологлобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (моиAT) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамм 4D4 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института эпитопам миоглобина человека. Штаммы получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c с клетками миеломы Х63-Ад8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 222Д. Клетки штаммов культивируют на среде 1 М с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. МонАТ, продуцируемые штаммом 4D4. относятся к классу JgGI, имеют константу связывания с антигеном 2,85х109М 1 и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина . Культуральные свойства штамма типичны для гибридом, продуктивность в титрах антител в культуральной жидкости и в асцитической. МонАТ не теряют способность к связыванию с миоглобином после .модификациии их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двухсайтных флуороиммунометрических системах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора. цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) № 222Д. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BALB/c иммунизируют раствором очищенного миоглобина человека . Первые инъекции миоглобина человека (Мч) проводят в сочетании полным и неполным адьювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию инъекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спленоцитов с клетками плазмоцитомы P3.X63-Ag8.653 проводят в присутствии 40% полиэтилен гликоля (Мол.м. 1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду 4V N Ё О 00 ГО Ч) о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

t1O. ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4729982/13 (22) 16.08.89 (46) 07.10.91. Бюл. М 37 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР, Институт клинической иммунологии СО АМН СССР и

Кооператив "Биос" (72) П.П.Лактионов, М.В.Нечаева, В.В.Рошке и Е.Ю.Рыкова (53) 578.085.23(088.8) (56) 1 lmmunoh Meth., 1981, 45, N. 3, р. 249—

254. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS.

MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МИОГЛОБИНУ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина в сыворотке крови человека. Целью изобретения является получение штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МонА1) к неперекрещивающимся

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике для количественного определения миологлобина человека в сыворотке крови, Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека.

Штамм 4D4 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института

„„Я Ц „„1682390 А1 (я)5 С 12 N 5/18, С 12 Р 21/08 эпитопам миоглобина человека. Штаммы получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c с клетками миеломы Х63 — Ag8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N- 222Д. Клетки штаммов культивируют на среде 1 M с добавлением 10 Я, эмбриональной телячьей сыворотки. МонАТ, продуцируемые штаммом 404, относятся к классу JgGl, имеют константу связывания с антигеном

2,85х109М и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина. Культуральные свойства штамма типичны для гибридом, продуктивность в титрах антител 10 в культуральной жидкости и 10 в асцитической. МонАТ не теряют способность к связыванию с миоглобином после.модификациии их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двухсайтных флуороиммунометрических системах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора. цитологии АН СССР под номером BCKK (П)

М 222Д.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/с иммунизируют раствором очищенного миоглобина человека. Первые инъекции миоглобина человека (Мч) проводят в сочетанийс полным и неполным адъювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию инъекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спленоцитов с клетками плаэмоцитомы

РЗ.Х63-А98.653 проводят в присутствии

40 (полиэтиленгликоля (Мол.м.1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду

1682390

1М добавляют 10-1 M гипоксантина, 4х10т

M аминоптерина, 1,6х10 M тимидина. Наиболее продуктивные клоны выделяют по результатам пятенного иммуноферментного анализа (ИФА) и радиоиммуноанализа (РИА), Их оказалось два, один из которых обозначают 404, Штамм 4D4 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Культура клеток состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток примерно одинаковой величины с крупными ядрами, Культуральные признаки.

Среда для культивирования — 1 М или

ДМЕМ с добавлением 10 у эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина.

Клетки культивируются при 37 С в атмосфере 4 — 6% COz. Посевная доза 0,2х10 кл/мл, клетки пассируют 1 раз в 2 — 3 дня, кратность рэссева 1;5 (из плотности 10 кл/мл). Культура полусуспензионная, выращивается в пластиковых культуральных флаконах.

Штамм продуцирует антитела на протяжении 50 пассажей в культуре.

Для выращивания штамма в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей линии BALB/с в количестве 10 кл на мышь, За 10 — 15 дней до прививания клеток мышь сенсибилизируют введением

0,5 мл пристана внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10 — 15 дней. Асцитная жидкость забирается 2 — 5 раз через 1 — 2 дня.

Общий выход асцитной жидкости 10 — 15 мл на мышь. Штамм перевивается с эффективностью не менее 80%, Продуктивность штамма.

Титр антител в культуральной жидкости 10 сохраняется неизменным на протя-2 жении 50 клеточных генераций, Титр антител в асцитной жидкости 10 сохраняется неизменным на протяжении 4-х пассажей.

Характеристика полезного продукта.

Штамм синтезирует MA класса IgG1.

Константа диссоциации иммунного комплексасоставляет2,85х10 М, МАсохраняют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединениями редкоземел ьн ых металлов.

Контаминация штамма, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.

Криоконсервирование, Клетки замораживают на криопротекторной среде, содержащей. %; 1M ДМЕМ

60; эмбриональная телячья сыворотка 7;

10 сыворотка крупного рогатого скота 23; диметилсульфоксид 10. Ампулы помещают в пенополистирольную закрытую коробку толщиной стенок 1 см, оставляют при -70 С на 20 ч, затем переносят в жидкий азот.

Размораживают при 37 С, Жизнеспособность после размораживания составляет

70%

Штамм отличается от других близким штаммов следующими признаками. Штамм

404 продуцирует монАТ, обладающие высокими константами связывания, которые не теряют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов, Эти свойства позволяют использовать монАТ в двухсайтн ых флуороиммунометрических тест системах на Мч. Пример 1. Получение штамма гибрид20 ных культивируемых клеток мыши Mus

musculus, продуцирующего монАТ к Мч.

Мышам линии BALB/с вводят 100 MKR раствора Мч в концентрации 0,5 мг/мл в 100 мкл полного эдьюванта Фрейнда. С интер25 валом в 3 недели проводят еще 2 инъекции в неполном адьюванте Фрейндэ. Зэ 4 дня до гибридизации водят 100 кмг Мч в 200 мкл физиологического раствора внутривенно. В следующие 2 дня повторяют инъекции внут30 рибрюшинно. Клетки селезенки иммунизированной таким образом мыши (10 клеток) объединяют с клетками миеломы мыши

Х63-Ag8.653 (5х10 клеток) в присутствии 1 мл 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.м.

35 1000. После добавления ПЭГ реакционную смесь центрифугируют 3 мин (200g), супернатант сливают, клетки ресуспендируют в 6 мл среды 1 М, содержащей 10% ЭТС, 10

M гипоксантина, 4х10 М аминоптирина и

40 1,6х10 М тимидина. Гибриды-продуценты отбирают с помощью пятенного ИФАсупернатантов их культур. На нитроцеллюлозные фильтры (8 пор 0,45 мкм) размером 4х4 мм с помощью микрошприца наносят 10 нг очи45 щеного Мч в обьеме 0,1 мкл, Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубируют в растворе 0,02% желатина в буфере TBS (0,02М трис-HCI, pH 7,5, 0,15М

NaCI), Обработанные таким образом фильт50 ры разносят по лункам 96 — ячеечного планшета и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре с 50 мкл супернаТВНТоВ культуральной среды в разведении от 1:10 до 1;10 . После инкубации фильтры

55 отмывают 3 раза в буфере и вносят по 50 мкл коньюгата антител козы против! gG мыши с пероксидазой хрена. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре фильтры отмывают описанным способом и связавшуюся пероксидазу, а

1682390

Составитель А.Маныкин

Техред М.Моргентал Корректор M.Кучерявая

Редактор Н.Рогулич

Заказ 3383 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул.Гагарина, 101 значит и антитела против Мч, детектируют по расщеплению субстрата (НрОг) в присутствии хромогена — 4-хлор-1-нафтола. Присутствие антител определяется по наличию и степени окраски пятен фиолетового цвета.

Для дальнейшей работы отобраны только высокопродуктивные и специфичные клоны по наиболее интенсивно окрашенным пятнам. Этих клонов всего два, их обозначают соответственно 806 и 404. Достоверное определение Мч методом пятенного

ИФА достигается при разведении супернатантов культуры клонов 806 и 404 1;10 .

Полученный штамм 806 вместе со штаммом

404 испытан в двухсайтном флуороиммунометрическом анализе на Мч.

Пример 2. Использование монАТ штамма 404 в двухсайтнам флуороиммунаметрическом анализе на миоглабин человека.

МонАТ выделяют из асцитных жидкостей осаждением насыщенным раствором сульфата аммония (1ч при 4 С). После центрифугирования (30 мин, 2000g, О С) осадок диализуют против буфера 0,025 М Na-фасфат, рН 7,5, 0,15 М NaCI, 0,05% Майз в течение 2 сут, затем проводят гельфильтрацию на колонке с сефакрилом S-300 (обьем колонки 500 мл), буфер элюции 0,0125М Na— фосфат, рН 8,4, 0,15М NaCI, 0,050% Бааз.

Выход пика иммуноглобулина контролируют по оптической плотности, степень очистки определяют по злектрофорезу в полиакриламиднам геле.

Очищенные монАТ штамма 404 сорби, руют иа полистирольных пробирках из раствора с концентрацйеи 0,2 мг/мл в 0,01М трис-НС1, рН 7,5,0,1М NaCI. В качестве проявляющих антител используют монАТ штамма 806, предварительно меченых Еи следующим образом. 2.5 мг очищенных монАТ штамма 806 растворяют в 0,5 мл 0,1М

Na-фосфатного буфера, рН 9,0. и добавляют изотиоцианатофенилкомплексонат евро5

40 пия (150-кратный молясный избыток), инкубируют 12-18 ч при 4 С.".r несвязавшегося реагента освобождаются гель-фильтрацией на колонке с ультрагелем АсА34, размеры колонки: 1х2; см, буфер элюции 0,05М трисHCI, 0,15M NaCI, 0,050 Бааз, рН 7.5 (TBS).

В пробирки с иммобилизаванными монАТ штамма 404 вносят и" 1 мкг меченых Еи монАТ штамма 806 в 350 мкл TBS; содержащего 0,02 твин-20 и 107 быч;-ей сыворотки. Затем с интервалом 15 с вносят па 50 мкл разведений сывороток или соответствующих ста дартов Мч. После инкубиравания в течение 15 мин при комнатной температуре жидкую фазу отсасывают при помощи водсструйнога насоса и добавляют в каждую пробирку за 400 мкл TPS, содержащего 0,20 твин-20 для отмывки. Процедуру отмывки повторяют 3 ра à-, и отмытые пробир,ки добавляют по 400 мкл усилива:,ощего раствора, выдерживают по 10 мин на встряхивателе и измеряют интенсивность флуоресценции на время разрешенном флуориметре.

Резльтаты опыта показыва ст, что даже при значительном разведении контрольной сыворотки (в 256 раз) получаю-, достоверный сигнал, а метод двухсайтнай времяразрешенной флуараиммунометрии позволяет определять уровень Мч в диапазоне концентраций от 2 до 1000 нг/мл. Аналогичный метод с использованием радионуклида i характеризуется меньшей чувствительностью — минимальная концентрация Мч в пробе 10 — 15 нг/мл. Кроме высокой чувствительности следует отметить быстроту метода 30 мин (в случае РИА около часа), что крайне важно для экспресс-диагностики инфаркта миокарда.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Мы musculus I, ВСКК,П) N 222Д вЂ” продуцент моноклоHàëüHûх антител к миаглобину человека.