Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.-продуцент моноклонального антитела, реагирующего с @ - субъединицей хгч, лгч, ттгч и лг и хг лощади

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммом N; ВСКК (П) 398 Д моноклональных антител (МкАт) позволяет разрабатывать иммунологические способы определения уровня гонадотропных и тиреотропного гормонов человека: ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в биологических жидкостях организма. Определение уровня указанных гормонов обеспечивает возможность-диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диагностики ряда эндокринных нарушений процесса репродукции и скрининга новорожденных с целью диагностики гипофункции щитовидной железы. Штамм получен путем гибридизации клеток миелом ы X 63 Ад 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной официг альным препаратом ХГЧ. Сливающий агент ПЭГ 1500. Селекция гибридных клеток осуществлена на среде HAT, проведены 2 клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки). Получено 100% положительных клонов. Условия выращивания клеток штамма № ВСКК (П) 398 Д: среда RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ФС), температура 37. С, газовая фаза - воздух с 5% COji. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток на 1 мл. Исследование МкАт осуществляют твердофазным иммунофер.ментным методом, в качестве антигена при этом используют препараты гормонов: ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ. Через 15-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши линии BALB/C, обработанной пристанем , получают асцитическую жидкость. Путем высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов, содержащие МкАт при этом составляет около 80-90%. МкАт реагируют с ХГЧ ЛГЧ. ФСГЧ и ТТГЧ в разведении 1:(105-10 ) в иммуноферментном и РИА тестах. МкАт, продуцируемые штаммом, реагируют также с ЛГ и ХГ лошади. МкАт не реагируют сД-субьединицей ХГЧ крупного рогатого скота и свиньи. Штамм депонирован под № ВСКК.398Д. XI ю о ю о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

3 М

О

О

К A8TQPCKOIVIY СВИДЕТЕЛЪСТВУ (21) 4793142/13 (22) 20,02.90 (46) 23,03.92. Бюл. № 11 . (71) Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР (72) Р.Фидлер и M.Ø. Вербицкий (53) 578,085.23(088.8) (56) ЕР ¹ 0265156, кл. С 12 P 21/00, 1988; (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS, MUSCULOS L, — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, РЕАГИРУЮЩЕГО

С а -СУБЪЕДИНИЦЕЙ ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ, ТТГЧ, ЛГ И ХГ ЛОШАДИ (57) Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Использование продуцируемых штаммом № ВСКК (П) 398 Д моноклональных антител (МкАт) позволяет разрабатывать иммунологические способы определения уровня гонадотропных и тиреотропного гормонов человека; ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в биологических жидкостях организма, Определение уровня указанных гормонов обеспечивает воэможность диагностики беременности у женщин на ранних сроках, диагностики ряда эндокринных нарушений процесса репродукции и скрининга новорожденных с целью диагностики гипофункции щитовидной железы. Штамм. получен путем гибридизации клеток миеломы Х 63 Ag 8.653 с клетками селезенки мыши линии BALB/С, иммунизированной офици-. альным препаратом ХГЧ. Сливающий агент

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано для разработки иммунологических способов определения уровня хориониче-. ского гонадотропина человека (ХГЧ), лютеи„„ Ж ÄÄ 1721090 А1

ПЭГ 1500. Селекция гибридных клеток осуществлена на среде НАТ, проведены 2 клонирования методом лимитирующих разведений (1 клетка на 3 лунки). Получено

100 ф, положительных клонов. Условия выращивания клеток штамма ¹ ВСКК (П) 398

Д; среда RPMI 1640 с 10 фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ФС), с температура 37. С, газовая фаза — воздух с

5 СОр. Способ культивирования.в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток на 1 мл. Исследование

МкАт осуществляют твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена при этом используют препараты гормонов:

ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ. Через 15-20.дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши линии BALB/С, обработанной пристаном, получают асцитическую жидкость. Путем высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52: 2 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют около 7 мг иммуноглобулинов, содержащие МкАт при этом составляет около

80 — 900/,. МкАт реагируют с ХГЧ ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в разведении 1:(10 — 10 ) в иммунот ферментном и РИА тестах. МкАт, прадуцируемые штаммом, реагируют также с ЛГ и

ХГ лошади, МкАт не реагируют c/3.субьединицей ХГЧ крупного рогатого скота и свиньи, Штамм депонирован под ¹BCKK.398 Д. низирующего гормона человека (ЛГЧ), фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГЧ) и тиреотропного гормона человека . (ТТГЧ) в биологических жидкостях организма с помощью продуцируемых штаммом мо1721090 ноклональных антител (МкАт) с целью диагностики беременности у женщиН на ранних сроках, мониторинга за состоянием беременных в группах риска, диагностики хорионэпителиомы и с целью диагностики патологии процесса репродукции и гипофункции щитовидной железы у новорожденных.

Известны моноклональные антитела к

ХГЧ, некоторые из которых, направленные против Р -субъединицы ХГЧ (j9-ХГЧ), перекрестно реагируют с ЛГ человека, другие специфичны для Р -ХГЧ, моноклональные антитела, направленные против а-субъединицы ХГЧ (a -ХГЧ), перекрестно реагируют с ЛГЧ.

Цель изобретения — получение штамма гйбридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего. моноклональные антитела, специфичные к а -ХГЧ, а -ЛГ,а -ФСГЧ, а-ТТГЧ.

Штамм получают следующим образом, В качестве антигена используют официнальный препарат хорионического гонадот ропина человека (ХГЧ), выпускаемый

Московским эндокринным заводом;

Мышей, линии BALB/Ñ иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в

1-й день — 500.ед. препарата в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), на 14-й и

28-й дни по 250 ед. препарата с ПАФ, реиммунизация на 56-й день — 2500 ед, препарата ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия.

Через 72-96 ч после реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию спленоцищв, Клетки селезенки сливают (гибридизуют ") с клетками мышиной миеломы Х 63 Ag 8.653. Сливающий агент — ПЭ Г-1500 (50%-ный раствор).

Селекцию проводят на среде НАТ, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов.

;Стандартные условия выращивания: среда. RPM I 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS), температура при культивировании 37ОС, газовая фаза — воздух с 5% С02..

Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза

500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

В организме. животного — мышь

ВА В/С. обработанная пристаном (1,0 мл в/брюшинно эа 5-10 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней, Полученный штамм гибридных клеток обозначен Ф 15. Штамм хранят в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной

5 коллекции клеточных культур под номером

8 CKK (П) 398 Д.

Данные видовой принадлежности: мышиные клетки. линии BALE/С. Гибридома секретирует моноклональные антитела про10

55 тив а-субъединицы ХГЧ,.ЛГ, ФСГ и ТТГ человека, определяемые иммуноблотингом и иммуноферментным методом. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены.

Штамм гибридных клерк продуцирует моноклональные антитела IgG класса, направленные против а -ХГЧ, а -ЛГ,а -ФСГ и .а-ТТГ человека. Концентрация полезного продукта (моноклональных антител против а-ХГЧ;а -ЛГ,а -ФСГ и а -ТТГ человека) в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитической жидкости около 5 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода 1;3000 в культуральной среде, 2х10 в асцитической жидкости, при концентрации антигена при нанесении на пластинки

30 ед./мл препарата .гормона.

Определение данных антител можно также проводить иммунофлуоресцентными и радиоиммунологическимй методами. Продукция моноклональных антител стабильна по крайней мере в течение 25 пассажей ин витра и 15 пассажей на животных.

Способ криоконсервации: 4х10 клеток в RPMI с 10% FCS и 10% DMSO, замораживание в пенопластовой коробке при -70 С, жизнеспособность клеток после размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности по включению клетками трипанового синего после 24 ч культивирования).

Использование штамма гибридных клеток N ВСКК(П) 398 Д.

При использовании. гибридомы получены специфические х а -ХГЧ, а -ЛГ, а -ФСГ и а -ТТГ человека моноклональные антитела путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Иэ 1 мл асцитической жидкости с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой выделено 5 кг моноклональных антител анти а-ХГЧ,а -ЛГ,а -ФСГ и а

ТТГ человека, Контроль на специфичность моноклональных антител проведен в системе твердофазного иммуноферментного анализа.

Моноклональные антитела реагируют с aХГЧ, цельной молекулой ХГЧ, ЛГ. ФСГ и ТТГ

1721090

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Muscufus L. ВСКК(П)

398Д вЂ” продуцент моноклонального антитела, реагирующего с g-субъединицей ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ, ТТГЧ, ЛГ и ХГ лошади, Составитель Г.Игнатьева

Техред М.Моргентал Корректор H.Ревская

Редактор В,Петраш

Заказ 928 Тираж Подписное

ВКИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Рэушскэя наб., 4/5

Производственно;издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 человека, ЛГ и ХГ лошади. МкАТ не реагируют с ЛГ и ФСГ коровы и свиньи.

Пример. Продуцируемые штаммом

МонАт используют для разработки твердо-. фазной системы иммуноферментного ана- 5 лиза для определения ХГЧ и ЛГЧ в биологических жидкостях организма. На пластинках для иммунологических исследований отечественного производства эдсорбируют МонАт протива -ХГЧ илиф-ЛГЧ (10 10 мкг/мл), инкубируют при 4 С в течение 1217 ч. Несвязавшиеся с пластиком Ат отмывают 3 раза ФБР, открытые места пластика

"забивают" добавлением 1 (,-ного раствора

БСА в ФБР. Инкубируют пластинки при 15 комнатной температуре в течение 1 ч. отмывают 3 раза ФБР с Твином-20 (0;5 мл на 1 л — 0,05ф,). Добавляют исследуемую пробу биологической жидкости. Инкубируют 1 ч при

37 С, отмывают 3 раза ФБР-Твин-20, добэв- 20 ляют коньюгированные с пероксидазой МонАт Ф15-ВСКК (П) 398 Д (концентрация 4 мг/мл) в рабочем разведении 1:1600 в ФБРТвин-20. Инкубируют. 1 ч при 37 С, отмывают 5 раз ФБР-Твин-20 и 3 раза холодной водопроводной водой, добавляют субстрат и хромоген (4 мг ОФД на 10 мл цитратного буфера рН 5,0 и 4 мкл 33 -ной перекиси водорода) на 20 мин при комнатной темпе-. ратуре. Останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты (2 М) и учитывают результат путем измерения оптической плотности при 492 нм.