Способ определения бензофурокаина
Использование: фармацевтическая химия , биохимические методы исследования для количественного определения бензофурокаина в крови, моче и других биологических жидкостях, Сущность изобретения : биологическую пробу экстрагируют спирто-хлороформнойсмесью.Экстракт хроматографируют в системе растворителей гексан-диэтиламин-метанол. Содержание препарата определяют флурометрически при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм. Среда для определения: пентанол-диэтиламин-едкое кали при их соотношении 5-3:0,2. 5 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4845467/14 (22) 28.05.90 (46) 15.05.92.Бюл. М 18 (71) Винницкий медицинский институт им.Н.И.Пирогова и Институт химии поверхности АН УССР (72) P.À.Móñèí,.À.À.Ïåíòþê, И.И.Геращенко, С.В.Ладутько, Т,Л.Полеся и И,Ф.Семененко (53) 615.475(088.8) (56) Временная Фармакопейная статья-42, 1983-88, утверждена М3 СССР, 1988. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗОФУРОКАИНА
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования, и может быть использовано для количественного определения бензофурокаина в биологической жидкости.
Известны следующие способы количественного определения бензофурокаина: титрометрический,,сущность которого состоит в титровании бензофурокаина хлорной кислотой в ледяной уксусной кислоте в присутствии индикатора кристаллического фиолетового, и спектрофотометрический, основанный на измерении разности спектров поглощения в кислой и щелочной среде, Однако этими методами невозможно определять количество бензофурокаина в биологической жидкости из-за низкой чувствительности и отсутствия специфичности способов определения, так как в ультрафиолетовой области поглощается огромное количество органических веществ, присутствующих в биологических жидкостях.
„„ Д „„173401 7A1 (si)s G 01 N 33 /48, А 61 К 31 /34 (57) Использование: фармацевтическая химия, биохимические методы исследования для количественного определения бензофурокаина в крови, моче и других биологических жидкостях, Сущность изобретения: биологическую пробу экстрагируют спирто-хлороформной смесью. Экстракт хроматографируют в системе растворителей гексан-диэтиламин-метанол, Содержание препарата определяют флурометрически при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм. Среда для определения: пентанол-диэтиламин-едкое кали при их соотношении 5-3:0,2. 5 табл.
Целью изобретения является создание возможности определения препарата в биологической жидкости, Поставленная цель достигается экстракцией бензофурокаина из биологической жидкости спирто-хлороформной смесью, очисткой тонкослойной хроматографией и флуориметрическим определением в среде диэтиламин-пентанол-гидроксид калия, Экстракцию бензофурокаина из биологической жидкости проводят следующим образом.
К 1 части плазмы крови (1 мл) прибавляют 5 частей спирто-хлороформной смеси (соотношение 1:1) и встряхивают 5 мин, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, отбирают спирто-хлороформинный экстракт, к остатку прибавляют еще
5 частей спирто-хлорформной смеси и повторно экстрагируют и выпаривают на водяной бане при 60-80 С досуха. Сухой экстракт растворяют в 0,1 мл воды и дозаторы наносят 0,05 мл на хроматографическую .пластинку "Силуфол" фирмы ЧССР и хрома1734017
55 тографируют в системе растворителей гексанметиловый спирт-диэтиламин (соотношение 8:1:1), проявляя хроматограмму в ультрафиолетовом свете.
Способ экстракции охарактеризован в табл.1.
Из данных табл,1 видно, что способ экстракции обеспечивает извлечение основной части количества бензофурокаина.
Другие органические растворители дают значительно меньшую степень экстракции бензофурокаина (табл.2), что делает невозможным их применение для аналитического определения его в биологической жидкости.
Далее пробу, содержащую бензофурокаин, очищают хроматографией в тонком слое сорбента. При проявлении хроматограммы в ультрафиолетовом свете бензофурокаин обнаруживается в виде зеленого пятна с Rf=0,33. После хроматографирования пятно бензофурокаина очищают вместе с адсорбентом и проводят флуориметрическое определение препарата в среде диэтиламин-пентанол-гидроксид калия. В связи с этим исследованы параметры флуориметрического определения бензофурокаина.
Из данных табл, 3 видно, что максимум флуоресценции достигается при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм.
Также была изучена зависимость интенсивности флуоресценции от количества бензофурокаина в пробе (табл.4).
Из данных табл,4 видно, что линейная зависимость флуоресценции сохраняется в пределах от 1 до 100 мкг препарата в пробе.
Воспроизводимость предлагаемого способа определения бензофурокаина была изучена при параллельном определении восьми проб, содержащих по 20 мкг препарата (табл.5).
Пример 1,Реактивы и материалы: хлороформ, спирт (95 -ный раствор); пентанол1;; 10 -ный раствор гидроксида калия в пентаноле; Гексан; метиловый спирт; хроматографические пластины фирмы "Силуфол" (ЧССР). Код определения. К1 части плазмы крови (1 мл) прибавляли 5 частей спирто-хлороформной смеси (соотношение 1:1) и встряхивали 5 мин в колбе с притертой пробкой, Затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин, после чего отбирали спирто-хлороформный экстракт. К остатку прибавляли еще 5 частей спирто-хлороформной смеси и повторно экстрагировали, Спирто-хлороформные экстракты объединяли и выпаривали на водяной бане при 60-80ОС досуха.
Хроматографическую пластину предварительно активировали в термостате при
120 С в течение 15 мин, Сухой экстракт растворяли в 0,1 мл воды и дозатором наносили 0,05 мл на хроматографическую пластину. Рядом с пробой наносили стандартный раствор бензофурокаина для сравнения. В цилиндрическую емкость наливали 10 мл смеси растворителей гексанметиловый спирт-диэтиламин (соотношение 8:1:1 соответственно), в которую помещали хроматографическую пластину и закрывали емкость крышкой, После того, как фронт растворителя поднимался на высоту. 80-100 мм, пластину вытаскивали и сушили при 120 С в течение 5 мин, Затем по раствору бензофурокаина для сравнения определяли пятно, соответствующее в пробе бензофурокаина (пятна должны быть на одном уровне от линии старта), которое очищали вместе с адсорбентом в пробирку. Туда же наливали 3 части диэтиламина (3 мл), 2 части пентанола (2 мд) и 0,02 части раствора гидроксида калия (0,02 мл), После перемешивания центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин.
После центрифугирования пробу переносили в кювету и определяли интенсивность флуоресценции на флуориметре при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм. Количество бензофурокаина определяли по градуировочному графику, построенному по стандартным растворам бензофурокаина.
Пример 2. К 1 части мочи(1 мл) прибавляли 8 частей спирто-хлороформной смеси (соотношение 1:1) и встряхивали 5 мин в колбе с притертой пробкой, затем центрифугировали при 300 об/мин в течение 30 мин, после чего отбирали спирто-хлороформный экстракт и выпаривали на водяной бане при 60-80 С досуха. Хроматографическую пластину предварительно активировали в термостате при 120 С в течение
15 мин. Сухой экстракт растворяли в 0,1 мл дистиллированной воды и дозатором наносипи 0,05 мл на хроматографическую пластину, Рядом с пробой наносили стандартный раствор бензофурокаина для сравнения, В цилиндрическую емкость вносили 10 мл подвижной фазы, гексан-метиловый спирт-диэтиламин (соотношение
8:1:1), помещали хроматографическую пластину и закрывали емкость крышкой. После того как фронт подвижной фазы поднимался на высоту 80-100 мм пластину вытаскивали и сушили при 120 С в течение 5 мин, Затем
1734017
Таблица1
Экстракции, Д
Обнаружено бензофурокаина в и обе, мкг
Количество бензофурокаина в и обе, мкг
27,8
54,1
106,3
30,0
60,0
120,0
92,7
90;2 . 88,6
П р и м е ч а н и е: раствор плазмы, содержащий бензофурокаин, готовили следующим образом к 1 мл плазмы крови добавляли 0,02 мл раствора с известным содержанием бензофурокаина и проводили экстракцию.
Таблица2
30
35 ющее бензофурокаина в пробе, которое вместе с адсорбентом очищали в пробирку, туда же наливали 3 части диэтиламина, 2 части пентанола и 0,02 части 107;-раствора
КОН в пентаноле. После перемешивания 5 центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, далее пробу переносили в кювету и определяли интенсивность флуоресценции на флуориметре при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны 10 эмиссии 490 нм. Количество бензофурокаина определяли по градуировочному графику, построенному на стандартных растворах бензофурокаина,.
Использование предлагаемого способа 15 позволяет повысить специфичность способа определения бензофурокаина, что даст возможность определять бензофурокаин р биологической жидкости, а также более глубоко изучать влияние препарата на биоло- 20 гические объекты (построить фармакокинетические препарата на биологические объекты (построить фармакокинетические графики, количественно оценить биодоступность бензофурокаина, определить возможные метаболиты).
Формула изобретения
Способ опредедления бензофурокаина, отличающийся тем, что, с целью определения препарата в биологических жидкостях, биологическую пробу экстрагируют спирто-хлороформной смесью, затем полученный экстракт подвергают тонкослойной хромотографии в системе растворителей гексан-диэтиламин-метанол и определяют препарат флуориметрически в среде пентанол-диэтиламин-едкое кали при соотношении инградиентов, соответственно равном 2:3:0,2, при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 490 нм, 1734017
Таблица3
Таблица4
П р и м е ч а н и е: Ep — единица флуоресценции раствора бензофурокэина, Ек — единица флуоресценции контроля (раствора, не содержащего бензофурокаина).
Таблица5
П р и м е ч а н и е: Х вЂ” среднее арифметическое;
S — средняя квадратичная ошибка;
V — коэффициент вариации.
Составитель В. Брусиловская
Техред М.Моргентал КорректорО,Кравцова
Редактор Ю.Середа
Заказ 1667 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101
П р и м е ч а н и е; в пробе содержится 40 мкг бензофурокаина, определения проводили на флуориметре БИАН-130 М, в качестве регистрирующего прибора использовали зашунтированный цифровой вольтметр с сопротивлением шунта 10 кОм.
