Способ получения человеческой м @ о @ -дисмутазы

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии, в частности к способам получения человеческой дисмутаэы Мп04 для терапевтических целей, например, в качестве противовоспалительного вещества. Способ получения человеческой дисмутазы предусматривает конструирование плазмидной ДНК pWS 550A, или pWS 490A, или p-WS 49tА,или pWS 371А, или pWS 372А, илирМЗ 373А,или AB, или рЕ025 -АС, илирЕ02б -AD, илирЕО 0, м или рЕОЬ2, или , или рЕО, или , или рЕ050, или рЕ051, которой трансформируют штаммы Saccharomyces cerevisiae, или плазмидУ pSV2 dhfr SOD1 или pSV2 dhfr SOD2, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют трансформированные клетки, выделяют и очищают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии, k табл.

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕОЪЬЛИН (51)5 С 12 Б 15/52 15/81

ГОсудАРстВенный нОмитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ОРИ ГННТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И AATEHTV

С . А

5 ТСтСТЫС тт тСССА тттАТ р

G т! (21) 4355336/13 (22) 14.03.88 (31) Р 3708306.б (32) 14.03.87 (33) DE (46) 15.0б.92. Бюл„ И 22 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (0Е), (72) Конрад Хекль, Вальтер Спевак, Элинборг Остерманн, Андреас Цефель, . Эдельтрауд Крыстек, Ингрид Маурер-фоги, Мария Йозефа Вихе-Кастанон, Кристиан Стратова и Рудольф Гаупт" манн (AT) (53) 575.224.2(088,8) (56) Аналогов в научно-технической и патентной литеоатчое не обнаружено. (54) спосоь получения челоВеческой.

ЖО -ДИСМУТАЗЫ (57) Изобретение относится к биотех- " нологии и генетической инженерии, в

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии,.в

t частности к способам получения человеческой MnO<"дисмутазы для терапев" тических целей, например, в качестве антивоспалительного средства.

Способ .заключается в том, что из . плацентарной или печеночной ткани человека- выделяют мРНК, получают воли . (А)+РНК, синтезируют двунитевую кДНК, конструируют банк кДНК, выделяют последовательность ДНК, кодирующую ..Mn<0-дисмутазу, при помощи зондов 1 с с с

5 - TGETA тт тс TGEGTIAGITò-3 т т т

„„ЯЯ„„1 741610 А3

2 частности к способам получения человеческой дисмутазы ИпО для терапевтических целей, например, в качестве противовоспалительного вещества. Способ получения человеческой дисмутазы предусматривает конструирование плазмидной ДНК рЧ8 550А, или pWS 490А, или pWS 491А,или pWS 371А, или pWS

3726, или pWS 373A, или рЕ024- РВ, или

pE025 -AC, илирЕ026 «AD, илирЕ040,,1 или рЕ042, или рЕ043, или рЕ044, или рЕ045, или рЕ050, или рЕ051, которой трансформируют штаммы

Saccharomyces cerevisiae, или плазмид1 .рЬЧ2 dhfr SOD1 или pSV2 dhfr SOD2, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют транс-. формированные клетки, выделяют и ow - Я щают целевой продукт путем экстракции, осаждения и хроматографии. 4 табл. г.или последовательност кДНК

2-дисмутазы человека, последовательность ДНК достраивают до стартового кодона или стоп кодона н епосд венно за CTapTosblH кодоном гена размещают митохондриальную ли е н или сигна льную последовательность

ДИК ИпО челов

Z-дисмутазы S.cerevisiae u ли еловека, последовательность ДНК, ко дирующую МлО<-дисмутазу, используютдля конструирования вектора зкспрессии, состоящего из промоторов AMI

ADHII, пар олигонуклеотидов

1741610 4

EBI. 1161/EBI 1164 + EBI 1167/EBI 1160 формулы

EBI 1161

Sph I

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG тТАСФтАТА<тТСТАТАТТТАТСТСАСССТСАТС(тСЮАААААА(тТСТСАС 1.

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTÑÒÒÑÒ

ТТТАТСАСААТОАТОАСОАСАСЛАСААСАААААТАСТСАЛСААСААА

EBI 1164 5

TG

EBI 1167

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA

САЛСААССЛТТТАТСТТАТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТ

TCAACTATTAAC

AGTTGATAATTGAGCT 5 EBI 1160

Xho I

EBI f161/EBI f164 + EBI 1159/EBI 1168 формулы

EBI 11б1

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCQACTTTTT×ÑÀÑÀÑTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGÀG

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTТТТТАТСЛСТТСТТСТТТСПСУ

TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAÀÀÀIAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5

TG

EBI 1159

5 ЛТАЛЛТАСААТАТСААССТАСАААААССАТЛСААТСАЛСТ*..

СЛАСААССАТТТТАТСТТЛТАСТТССАТСТТТТТССТАТСТТАСТТСАТ .ТСААСТАТТААСТАТАТС

AGTTGATAATTGATATAGAGCT 5 EBI 1168

Xho I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1165/EBI 1166 формулы

EBI 1161

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

С

AAATATTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTСТТСТ

TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAAÑÀÀÀ

EBI 1164 5

7G

EBI 1165

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA

GAAGAACCATTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT

ТСАЛСТАТТЛАСТАТАТССТААТАС

AGTTGATAATTGATATAGCATTATGAGCT 5 EBI 1166

Xho I ,или С1Л 1, сигнала инициирования, -- стоп-кодона и теРми Р митохондриальной лидерной или . . лученными векторами экспресии РЫ$550А, сигнальной последовательности. gaccha- или ри$490А, или pM$491A, или ощУсев cerevisiae или человека, РИ$371А, или .pM$372A или рН$333А, 5 1741610

& или pEO24 - AB, или рЕ025 - АС, или Я-буфер: 100 мИ трис, рН 7,5, 1О мИ рЕОй " AD, или рЕ040, или рЕО41, MgCI<., 1 мМ .этилендинитрилотетраукили рЕ042, или рЕО43, или рЕ044, или сусной кислоты ЭДТУК); рЕ045, или рЕ050, или рЕ051 трансфор- агар ЛБ: жидкая среда ЛБ, 15 r/ë бак мируат штаммы ЯассЬакошусез cerevi- тоагара;

siae vw плазмиду рЗЧ2 ЙМг 8093 или жидкая среда ЛБ: 10 г/л бактотриптоpSV2 dhfr, которой трансформируют на, 5 г/л дрожжевого экстракта, . штаммы культивируемых клеток, культи- 5 r/ë NaCl, 10 И NaOH до рН 7,4; вируют трансформированные клетки, 10 раствор лигирования: 66 мИ трис-HCI, выделяют и очищают целевой продукт рН 7,6, 10 мИ И С1, 5 мИ ДТТ, 1 мМ путем экстракции, осаждения и хро- АТР, 1 ед. Т4-ДНК-лигазы; матографии. раствор нейтрализации: 0,5 И трисПри осуществлении предлагаемого HCI, РН 7,50» 1,5 И NaCl; способа используют промотор ADHI- 1я Ьуфер Е:50 мМ КСI, 50 мМ NaCl, 50 мМ (pES103), регистрационный номер 08И трис-НСI, рН 8,0, 10 мИ ИрС1, 4013 (фрагмент Наш HI/XhoI с длиной раствор предварительной гиЬридизации:

1500 п.о. (пар оснований); 5 х буфер SSC, 5 к раствор Денхардускоренный промотор ADHI, регистра" та, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, ционный номер DSM 4016 (pMS 323E) 20 рН 6,8, 1 мМ Na P O, 100 мкИ АТР, (фрагмент Ham НХ!ХЬо I с длиной . 0,1 додецилсульфата натрия(ДСН!,30

400 и oo); 100 (50) мкг/мл денатурированной обтерминатор AIHII (рСР2), регистра-. работанной ультразвуком ДНК из спер.ционный номер BSM 4014, (фрагмент мы лосося; ,Xba I/Hind III с длиной 336 п.о.); - 25 АБАЗ регистрационный номер ESN 4015; буфер Ham HI: 150 мй КаС1, б мМ S.cerevisiae DBY47:a,leu 2, his 3, трис-НС1, рН 7,9, 6 мМ MgCI<, - trpl Ura 3;

100 мкл/мл альбумина сыворотки круп- среда СЦ-УРА: 0,67 Ф В7 В(ВИсо) ° ного рогатого скота (АСКРС); 23 глюкозы, 23 50 к смеси аминокисбуфер Коре: 58.мМ трис-НСI, рН 8,0, Зо лот (г/л): гистидин 1; лейцин 6»

10 мМ MgCIg, 50 мМ NaCI; . . триптойан 2,5," лизин 4; аденин 1,2; раствор ренатурации: 0,5 И ИаОН,, аргинин 2;.метионин 1, фенилаланин

1,S М NaCI; б; треонин 5; изояейцин 6; раствор Денхардта .(50х) 1 t- поливи- буфер Бпи I: 10 мИ трис-НС1, рН 8,0, нилпирролидона с мол.массой 360000, 20 мМ КС1, 10 мМ MgClg, 10 мИ 2-мер"

1 г. Фиколла, 1 г АСКРС, Н О до каптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС;

100 мл; буфер Sph I: 10 мИ трис-НС1, рН 7,5„ .E.coli С 600: F, sup E44, йМ1. 100 мМ NaCl „10 мИ NgCQ, 10 мИ 2thrl leu56, lac Yf ton А2И (АТСС меркаптоэтанола, 100 мкг/мл АСКРС;

3372")» 40 SSC (20_#_): 3,0 М NaCI» 0,3 М .Na>- .

Е. col i ХМ 101: sup Е, thi h, (lac-pro цитрата, рН 7,0;

AB), Р, tra Э3&, pro АВ» Iас Х 2, SSPK (20 ): 3,6 И МаС1, 0,2 М Ка ЯРО+ ° .Д15, 20 мИ ЭДТУК, NaOH (10н.) до рН 7,4; буфер Х: 100 мИ NaC1; 50 мИ трис"HCI, . буФер ТЕ: 10. мИ трис"НС1» рН 8»0;. рН 7,5, 10 мИ ЙцС1, 1 мИ дитиотрие- 1 мМ ЭДТУК; тола (ДТТ); : :, ": буфер Па I- 50 мИ трис-НС1 рН 8,0, буфер Y: 10.мМ трис-.НС1, .рН;7,5» . ... .. 10 мМ MgCI, 60 мИ ЫаС1, 10 мИ MgCIg, .1 мИ::::Зфф9" -:.: топ-агароза: жидкая среда ЛБ, 0,73 каптоэтанола, 100 .мкг/мл AC_#_PC -:".= : ;":::.-,, - агарозы; раствор. гибридизации c00788Tcr fVF,,-.. . раствор предварительной промывки: раствору предварительной гиЬрйдиза-:.,- »,-„::;; . 1И ВаС1,, 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, ции, но без ДНК из. спермы лосося:;,,:. ; .;;::, :: . 1 мМ ЗДТУК, О., 1ь ДСН. содержащий фрагмент Кленова:реакцйрйв;:,,:;:.::.: :Пример l. ный раствор 22 мкл ДНК/Н О, 2,5 икл,:::::;, -;:,-. ".: Конструирование генобанка кДНК.

10 буфера HTP (0,5 И трис-НСl„pH. -: .-"

dTTp, 2,5 ед, фрагмента Кленова . температуре ниже -80 С» экстрагируют ,.(0,5 мкл); РНК, из которой получают поли(А)+РНК.

174161

Синтезируют ДНК, клонируют ее в

ЕсоКХ ®t10, используя E,coli C600.

Титр кДНК фаговф gt 10 составляет

1,2xl0 . бляшкообраэующих ед. мл, а число независимых клонов 1>IO .

Il р и м е р 2. Амплификация генобанка Agt 10. °

Штамм-реципиент E. col i (например, С 600, Генотип F E44, sup Е44.

thill, tbrl, 1eu Вб, 1ас YI, ton А21Л выращивают при 37"С в течение ночи в среде ЛБ, содержащей 0,2ь мальтозй.

Культуру центрифугируют и суспендируют в 10 мМ раствора сульфата маг." 15 ния до.оптической .плотности 4,0 при

600 нм. Полученные Ng ;клетки хранят при 4ОС. Клетки смешивают с сус» пензией фагов (no 50000 бляшкообраэующих единиц генобанка ДНК на пластину) и инкубируют в течение 20 мин при 37 С. Затем добавляют расплавленную и доведенную до 42 С топ-агарозу (содержащую 10 мМ сульфата магния), смешивают., выливают на предварительно 25 нагретые ЛБ-агаровые пластинки (диа„ метром 13,5 см), содержащие 10 мМ сульфата магния, и инкубируют в те" чение б - 12 ч при 37 С.

Пример 3. Первичный скрининг 30 для идентификации рекомбинантных

9-фагов, а). Обработка нитроцеллюлозных фильтров.

Пластинки по окончании .инкубации охлаждают до 4 С. Нитроцеллюлозные фильтры кладут на поверхность пластинок. Через 1 мин после пропитки фильтры осторожно удаляют, кладут в раствор денатуратора и инкубируют 40 в течение одной минуты при комнатной температуре. Нейтрализацию осуществ" .ляют в растворе нейтрализатора в течение 5 мин при комнатной темпера" туре, затем инкубируют в течение 45

)О с в буфере 2

Синтез олигонуклеотидов проводят на синтезаторе 381 А. Олигонуклеотиды очищают электрофорезом в полиакриламидном геле (20ь в 8 М мочеви" не) с последующим обессоливанием на

Сефадексе U-50. Синтезированные та- 4 ким образом ДНК-зонды комплементарны

I последовательностям оснований РНК, 0 8 кодирующим аминокислоты 39 - 46(a) и 200 - 207(б): Они имеют следующие последовательности оснований:

С С С а) 5 TG ITA ТТ ТС ТС IGT IAC ITT 3

Т Т Т

А С А б) 5 TC IGT ТАС ТТ ТС ССА ТТ IAT

С Т С в). Гибридизация in situ.

С целью удаления с нитроцеллюлоэы остатков агароэы и бактерий фильтры инкубируют в растворе предварительной промывки при 65 С в течение о нескольких часов при перемешивании. фильтры инкубируют в течение 1 о.

12 ч при температуре 37 С в раство" ре предварительной гибридизации, который подвергают предварительной вакуумной дегазации.

Используемые для гибридизации радиоактивно меченные ДНК-зонды (около

1 107 срм/мкг) добавляют к нагретому до 37 С и дегаэираванному раствору гиЬридиэации. Для поддержания на вы" соком уровне концентрации ДНК в растворе гиЬридизации используют минимальное количество жидкости . ГиЬридиэацию осуществляют в течение 1218 ч при 37ОC.

Нитроцеллюлозные фильтры три раза промывают в Ьуфере 6< SSC u

0,054 ДСН (4 С), два раза в течение

30 мин при 4 С, а также в свежеприготовленном растворе, содержащем 3 И хлорида тетраметиламмония, 50 мМ трис-НС1, рН 8,22 мМ ЭДТУК и 0,054

ДСН следующим образом: три раза при комнатной температуре, два раза в течение 30 мин при комнатной температуре и три раза в течение 30 мин при 4$OC после чего сушат на воздухе. Рентгеновскую пленку .экспонируют о в течение 2 - 8 дней при - 70 С.

П.р и м е р 4. Очистка бляшек.

После проявления авторадиограмм из агаровой пластинки выделяют те участки, которые дают положительный сигнал гибридизации на обоих нитро" целлюлозных Фильтрах. Для этого желаемое место мааляют из агара и пе" реводят в 0,3 " 0,6 мл Я -буфера.

Добавляют по одной капле хлороформа, фагам дают диффундировать из агара в течение ночи при 4 С и каждую отдель-,. о ную фаговую суспензию в виде несколь", ких разбавлений наносят на пластинки.

9 1 7416

Пластинки, имеющие 300 - 1000 бляшек, снова используют для изготовления копии нитроцеллюлозного фильтра, который подвергают гибридизации с использованием обоих ДНК-зондов. 3Т0Т процесс повторяют до тех пор, пока все бляшки одной пластинки не дадут положительный сигнал гибридизации.

П р,:и м е р 5. Анализ полученных фаговых клонов. .. а). Титрование )1-фагов. . Суспензии фагов разбавляют % -буфером в соотношении 1:10, смешивают и наносят на пластинки. После инкуо бации ри 37 С определяют титр в бляшкообразующих единицах. Для очи-" щенных фаговых суспензий титр составляют 2,2 - 8,6МО 1О ед. мл.

6). Получение 9 -Фаговой ДНК. .После выделения и титрования гомогенных фаговых клонов их наносят плотностью 2 >10 единиц (13 5 см чашки Петри с культуральной средой следующего состава: 1,53 агарозы, 25

10 г/л триптофана, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л НаС1, 10 мИ И 304, и

0,2 глюкозы) вместе с 200 мкл Ngклеток E.eoli С 600 (оптическая плотность 4 при 600 нм), инкубируют "в ЗО течение 5 ч при 37 С и затем охлаждают до 4 С, Злюцию Фагов осуществляют переслаиванием пластинок 8 мл

9,-буфера и несколькими каплями хлороформа при слабом качании при 4 С в

10 полнения гена конструируют и синтезируют с учетом выбора дрожжевого ко-. дона 2 пары олигонуклеотидов (фрагмент XhoI/Xbal) согласно формуле (ОП1):

35 .. течение ночи. Очищенную центрифугированием надосадочную жидкость удаляют и Фаги .центрифугируют при 5000 об/мин, в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления 40

500 мкл 3-буфера и инкубации с рибо" нуклеазой А. (10 мкг/мл) и дезоксирибойуклеазой (1 мкг/мл) в течение 30 мин при 37 С и концентрацию соли повь-. ю шают добавлением 25 мкл 0,5 И ЭДТУК, t2 мкл 1 И трис-НС1, рН 8;О и 6 5 мкл .20ь ДСН и инкубируют при 70 С в течение 15 мин. После экстракции фенолом и двукратной экстракции смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) ДНК осаждают добавлением 0,1 объема 3И ацетата натрия с рН 5,2.и

2 объемов спирта, центрифугируют, промывают 70>-ным спиртом, сушат растворяют в 50 мкг буфере TE. в). Рестрикционный анализ.

По 2 мкл раствора ДНК инкубируют с 5 ед. Ecokl 8 буфере Х в течение

2 ч при 37 С, полученные Фрагменты

-о разделяют в 1Ф-ном агарозном геле.

Фрагменты длиной 500 - 1000 п.о. элюируют из геля и подвергают анализу. г). Анализ последовательностей.

100 нг фрагментов встраивают в соответственно приготовленную форму дзДНК (репликативная форма, 50 нг) вектора путем инкубации в течение

2 - 12 ч при 14 С в Я мкл раствора лигирования. Рекоибийантной конструкцией с обозначениями BS3, BS5, ВВ8, ВЯ9, ВБ12, ВМЭ ° BSXXII трансформируют компетентные клетки Е.coli (штамм 1И 101).

Выделяют однонитевую ДНК рекомбинантных Фагов и проводят анализ последовательностей по Сангеру при использовании вычислительных программ, Выделейный клон о (З88) содержит кодирующую последовательность аминокислоты 22 зрелого энзима.

Пример 6. Конструкция экспрессионной кассеты.

Для экспрессии человеческой ИпОвлисмутазы (чйп-Д) в дрожжах используют промотор ADHI первоначальной длиной около 1500 п.о., укороченный промотор ADMI длиной около 400 п.о. и ADHII терминатор, а). Пополнение, гена.

Так как у выделенного клона 8 кДНК на N-конце отсутствует участок, соответствующий 21 аминокислота, .для по5 TCGAGTATACAATGAAGCACTCTTTGCCAGACTTG

Э САТАТСТТАСТТССТСАСАААСССТСТСААС

Xho I

CCATACGAGTACGGTGCT

GGTATGCTGATGCCACGAGATC

ХЬа I и (Фрагмент ХЬа I/Neol согласно формуле (ОП 2):

5 CTAGAACCACACATCAATGCTCAAATCATGCAA

3 TTGGTGTGTAGTTGCGAGTTTAGTACGTT

ХЬа Е

ТТССАССЛ СТСТААССАС

AACGTGGTGAGA TTCGTGGTAC

Neo I

ОП1 вставляют через Xho I/Õbà I в плазииду Ч17 (полученную из pUC18 после рестрикции Hinr II и введения

12 плазмиду PKHI,.ñîoòeåòñòâåíío РКН2 через Xho Е/Есо RI.

В плазмиду РЕ$ 103, содержащую промотор ADHI в качестве фрагмента

Bam I/ Xho Е длинои 1500 пеое в

PES 102 (PES 102 представляет собой производное pQC18, которое в месте разреза Hinc ЕЕ содержит линкер

Xho Еу, вводят линкер Bgl II после рестрикции Вша Е (1 мкг плазмиды подвергают перевариванию 5 ед.

Sma Е в буфере Sma Е в течение 2 ч при 37 С), очистки и выделения. Полученную таким оЬразом плазмиду превращают в плазмиду Р154/Ярестрикцией инкубацией с фрагментом Кленова и повторным лигированием, После переваривания Xho. I u Hind

ЕЕЕ в буфере. Коре в плазмиду pESI03 вставляют синтезированный линкерXho I, Eco kI, ХЬа Е, Hind III. Этот линкер имеет следующую последова" тельность:

ТССАОСААТТСТСТАСАА

ССТТААСАОАТСТТТССА.

8 плаэмиду р150/1 (после переваривания ХЬа I/Hind III в буфере Коре) вставляют терминатор ADHII, получая плазмиду 150/2. Терминатор ADHII получают следующим образом. Плазмиду

pNW5 ADHII переваривают сначала

Hind III, затем Spn I и фрагмент длиной 605 n,о. клонируют в вектор

718 и в место разреза HincII вставляют линкер ХЬа I (СТСТАСАС). фрагмент Xba I Sph Е длиной 335 п.о. вводят в pUC18 (pGD2).

Вектор 718 получают за счет того, что в pUC18 вводят линкер Hind ЕЕЕ по сайту Вша Е. Иесто мультиклонирования в 718 содержит Eco RI, Sst I, Kpn I. Hind III, Bam HI, ХЬа I, Sal1I, Pst, SphI. После переваривания ХЬа I и Hind III терминатор ADHII выде.ляют. Таким образом, эа исключением вводимого через Xho I Eco RI гена плаэмида р150/2 содержит необходимые для экспрессии гена промотор длиной около 1500 п.о., линкер Xho I длиной

7 п.о. линкер Eco kI длиной. 6 п.о., линкер ХЬа Е длиной 7 п.о., терминатор длиной 329 п.о. Эти единицы вставляют через Ваш HI/Hind ЕЕЕ в вектор р154/2. В получаемой плаэмиде рКН1 заменяют промотор ADHI на укороченный промотор ADHIk иэ фрагмента Bam HI/

/Xho I (длиной 412 п.о.) плазмиды

РКН2.

17416 линкеров Xho I (dCCTCGAGG) и рестрикции Smal полученной плаэмиды

pES102 с последующим выделением линкеров Nco I (dCCCATGGG), а ОП2 через

ХЬа Е/Nco Е-следующим образом, По 4 мкг ДНК 717 переваривают

10 ед. ХЬа I u Nco.I или Xho Е и

ХЬа Е в течение 2 ч при 37 С и очи" щают путем гельэлектрофореза (0.7ь 10 агарозы). По 5 мкл синтезированных нитей ОП1 и ОП2 (каждый раз 10 рИ/ /мкл) перемешивают, инкуЬируют в течение 10 мин при температуре 65 С и медленно охлаждают до комнатной температуры, flo 1/10 полученного объема подвергают лигированию с 50 нг разрезанного Хпо Е и Xba Е вектора (в случае ОП1) или разрезанного

ХЬа Е и Nco I вектора (в случае ОП2). 20

После двойного переваривания

Sea I u ХЬа Е в буфере Коре в течение

2 ч при 37 С, очистки и выделения о разрезанных векторов путем гельэлект" рофореэа HSOD2 и НЗОВЗ подвергают 25 лигированию (клонирование олигонук" леотидных пар ОП1 и ОП2) с получением . плазмиды HSODY, которую гидролиэуют рестриктаэой Nco I, инкубируют с фраГментом Кленова и гидролиэуют ЗО рестриктазой Есо RI, При этом 5 мкг

ДНК инкубируют с 18 ед. Nco I в течение нескольких часов в 50 мкл 6y" фера Х при 37 С, разрезанную ДНК очищают гельэлектрофореэом и половину инкубируют с фрагментом Кленова.

ДНК очищают гельэлектрофореэом, выделяют и гидролизуют 7,5 ед. Eco RI в 20.мкл буфера Х, еще раэ очищают. и выделяют. Плаэмидой В88, содержа- 4, щей выделенный клон 8 кДНК, трансформируют компетентные клетки Е.coli .(штам IM101) и получают плаэмиду.

10 мкг плаэмиды переваривают с

25 единицами Tha Е в 40 мкл буфера 4

Thai в течение 8 ч при 60 С, фрагмент длиной 759 п.о. гидролизуют с помощью Есо RI с последующей очисткой гельэлектрофорезом. Фрагмент Tha I/

/Eco kI оЬъединяют с плаэмидой

HS0D4, получая HSOD6. Плазмида

Н$006 содержит полную кДНК для чИп Ле включая Het, При этом сохраняется рамка считывания. б} . Конструкция экспрессионной кассеты.

Плаэмиду HSOD6 переваривают с

Xho Е и Eco RI в буфере Коре, выдвеяет фрагмент Xho I и вводят в

1741610

5

25

У

Табли ца

Вектор

В,обе плаэмиды вставляют по сайтам Xho I/Есо RI полный ген кДНК, вырезанный иэ HSOD6. Получаемые плазмиды HSOD7/1 и HSOD7/2 отличаются друг от друга только различными промоторами ADHI u ADHIk. После двойного переваривания BgIII/Hind ХХХ и выделения экспрессионных фрагментов изготовленные экспрессионные кассеты вставляют в соответственно подготовленные дрожжевые трансфор" мационные векторы 7Ер13 (АТСС 37 115)

pIDB207 (DSN 3181) pEAS102 YIp5 (АТСС 37062) через места разреза .Ваш НХ и Hind Ш, Пример 7. Получение пригод". ного для экспрессии дрожжевого му танта Ип=Д.

Ген дрожжевого мутанта Ип=)1 содержится в качестве фрагмента Bam HI в векторе PL41. После рестрикции

Bam HI фрагмент длиной 2045 п.о. очищают гельэлектрофорезом„ выделяют и субклонируют по сайту Bam HI в вектор VO.

Вектор VO получают за счет того, что 1 мкг рЧС18 гидролизуют рестрик.-. таэой Hind III, фрагмент выделяют из геля, выступающие концы пополняют. полимеразой Кленова и лигируют T4"ДНК лигазой, Полученную плаэмиду SODYi превращают в БОРОЗ путем гидролиза рестриктазой Nrv1 и встраиванием линкера

Hind III (СААССТТС). В место разреза вставляют ген URA3, полученный из

p0RA3. SODY3 переваривают с Hind III идефосфорилируют в следующих условиях. К 40 мкл реакционной смеси до" бавляют 40 мкл М110, 10 мкл 1 мИ ЭДТУК

5 мкл трис-НС1, рН 9,5, 1 мкл 100 мИ спермидина и 1 мкл (1 мг/мл Н О) щелочной фосфатаэы кишечника теленка (ФТК) и инкубируют при 36 С. По истечении 15 мин еще раэ добавляют мкл ФТК и инкубируют в течение

15 мин. Дефосфорилированный вектор очищают электрофореэом в агаровом геле. 2 мкг плаэмиды рУВАЗ режут

Hind III и фра гмент длиной 1, 2 т. и -.о. содержащий дрожжевой ген Я АЗ, выделяют и вставляют в подготовленный вектор.

Получаемые таким образом ппазмиды

S0DY7 и SODYB содержат ген БКАЗ в дрожжевом гене Ип-Д .и различаются ориентацией гена URA относительно ,гайа Ма-Д

Ориентацию гена И АЗ относительно гена Ип-Д можно устанавливать, так как ген ДЖАЗ содержит асимметричное место Pst Х.

Плазмидой SODY7 и SODYÂ трансформируют штамм DBY 747 (генотип а, leu 2, his 3, trp1, ura3) следующим образом, 2 мкг SODY7 и SODY8 режут

50 ед. Bam HI в 200 мкл буфера

Bam HI (150 мМ NaC1, 6 мИ трис-HCl, рН 7,9, 6 мИ NgCl,. 1 мМ ДТТ) и всю смесь (без отделенйя части р11С) экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. ДНК растворяют в воде и используют для трансформации дрожжей.

Трансформанты выращивают в среде о

SC-URA в течение ночи при 28 С.

Клетки отделяют центрифугированием, разрушают и исследует на содержание в. них Ип-Д: При этом для определения

Ип-Д, с одной стороны, и Cu/Zn=Ä, с другой стороны, работают по известHblH методикам с использованием гельэлектрофореза путем разделения протеинов с, последующим окрашиванием нитросиним тетразолием. Повысить чувствительность можно путем окрашивания. дианизидином. Для обеспече30 ния дальнейшего анализа применяют спектрометрический .метод с использо" ванием щелочного диметилсульфоксида в качестве выделяющей кислород сис" темы и цитохрома С в качестве восстановителя. Мп.-Д и Cu/7n=Ä можно различать путем добавления KCNi

Штаммы SODY/72, SODY7/6, SODY7/8 и .SODY7/10. не проявляют активности

Mn- -Д.

Пример 8. Получение экспрессионных векторов. .Иэ плаэмид HSOD7/1 и HSOD7/2 вырезают фрагменты Bg III, Hind III.

Плазмиды YEp13, pIDB u PEAS 102 также гидролиэуют Hind III u Bam HI.

По 50 мкг векторной ДНК и 200 мкг вставки лигируют и трансформируют в штамм Е.coli НВ 101., В табл.1 приведено обозначение соответствующих плазмид.

Вставка HSOD7/ 1 ) HSOD7/2

YEpl3 pWS 550A рЧЧ 371А

pIDB207 рИБ 490А pWS 372A

pEAS102 pVV 491А pWS 373A (Пример 11. Синтез линкера.

Изготавливают шесть различных олигонуклеотидов ЕВ1656, ЕВ1636, 26 EBI643, EBI643, EBI646, EBI660 и

EBI638 со следующей последовательностью и длиной

ЕВт, 656!.

5l 3 ТССАСТ АТАС ААТСТТССССААААСАСС ТССАССТААТТТА

-ЮВ Ю

EBI 536: 41 п,о .

3.

ТСТТССТТАААТТАССТССАССТСТТТТССССААСАТТСТАТАС

44 п.о.-.

EBI 643:

I

ЕВХ 646:

AACAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTCTCCACCACAGGAAGCA

ССАСААСС

48 п.о. ф ) 3, AGTGCTTGGTTCTCCTTGCTGTGGTGGAGAGCAATGACAAACCACCCТ.

; }Ят660:

48 п.о. .,5

АА(ЖАСТСТТТСССАСАСТТСССАТАССАСТАСССТССТ .

ЕВХ 638.: 39 п.о.

3

СТАСАССАСССТАСТССТАТСССААСТСТСССАААС

36 п.о.

15 17416

fl р и м а р 9. Получение пригодного для трансформации дрожжевого штамма (W830"53).

Получают дрожжевой штамм, который, кроме. описанных для штамма SOOY/2 генетических маркеров, дополнительно содержит мутацию в одной из лизосомальных основных протеаз и, таким образом, при разрушении дрожжевых клеток выделяет меньше протеза. Для этого дефицитный -Мп-Д штамм

8ОЭ77/2 скрещивают с дефицитным по протеазам штаммом 7782025 (а, leu2, his3, trpf, ura3, pep4}. Штамм :

VVS30-5g можно трансформировать, он отвечает соответствующим требованиям.

Такие скрещивания можно с успехом осуществлять с другими известными дрожжевыми штаммами, например, с 20 20

В-12.

Пример 10. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах.

Штамм 80Ь7/2 трансформируют плазмидами pWS371A, рУ8372А и pWS373A.

Трансформанты исследуют на экспрес" ию. Трансформанты выращивают в жид10

1Ь кой среде SC-1leu при встряхивании.

100 мкл культуры инокулируют в 4 мл

YP5XD (1Ф дрожжевого экстракта, 23 пептона, 54 глюкозы) и выращивают в течение ночи, клетки отделяют и расщепляют согласпо примеру 7. На активирующий гель наносят такое ко" личество сырой жидкости клеток, которое соответствует 1 мл культуры.

Опыт по определению активности проводят по примеру 7. !

Дрожжевой штамм 77830-5g (leui, his3, trpf, рер4. sodf) также трансформируют плазмидами рМ8550А, pWS49QA.

pVV491A, Измеренное в дрожжах в этих условиях количество Nn-Д соответствует примерно 0,5 мг/л культуры.

Олигонуклеотиды ЕВ?636, ЕВЕ643, ЕВТ64б я ЕВ1660 фосфорилируют с

5 -концов в следующих условиях.

Исходная реакционная смесь и 1 содержит 2 мкл EBI 636 (100 пмоль), 1 амкл 10хлинкерного буфера киназы, 3 мкл 10 мМ АТР, 1 мкл Т4-полинуклеотидкиназы (10 ед./мкл), 3 мкл воды.

Исходная реакционная смесь М 2 аналогична. смеси И 1, но с 2 мкл (100 пмоль) EBI 660.

Исходная реакционная смесь У 3 содержит 2 мкл олигонуклеотида ЕВ1 643

1741610

1S (100 пмоль), 1 мкл 10алинкерного буфера киназы,, 3 мкл 10 мИ АТР, 1 мкл Т4-полинуклеотидкиназы (10 ед./

/мкл 1 мкл ВОДЫ)

10 линкерный буфер киназы состоит из 0,7 И трис"НС1, рН 7,6, О,! И

MgC1, 0,05 И ДТТ.

Реакцию осуществляют в течение

30 мин при 37эС..Затем Т4-полинуклео- lð тидкиназу инактивируют путем нагрева до 100 C.

Олигонуклеотиды ЕВХ 656 и EBI 638, которые образуют 5 -концы готовой вставки ДНК длиной 128 п.о.!

Pvu II

TTTAACCAAGAAGGGTGGТТТСТСАТТССТС

AAATTGGT7CTTCCCACCAAACAGTAACGAG

Лизин

TCCAGCACAGCAAGGAGAACCAAGCACTCTTT

AGGTGGTGTCGTTCCTCTTGGTTCGTGAGAAA

GCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT 3

CGGTCTGAACGGTATGCTGATGCCACGA

ХЪа

30! не фосфорилируют, чтобы избежать образования мультимерных вставок ДНК на последующей стадии реакции лигирования. 35

Линкер конструируют иэ отдельных олигонуклеотидов по схеме:

5 EBI656 P EBI643 P ЕВХ660 3

3 EBI636 Р ЕВХ646 P ЕВХ638 5

К реакционной смеси Р 1 добавляЮт 2 мкл (100.пмоль) ЕВХ656, а к реакционной смеси!f 2 - 2 мкл EBI 638 (100 пмоль) и проводят реакцию гиб- 45 ридизации олигонуклеотидов друг с другом. B исходной реакционной смеси Р3 содержатся уже 2 комплементарных . олигонуклеотида (EBI 643. ЕВХ 646).

3 смеси нагревают в течение 2 мин при 100 С и медленно охлаждают.. о

Получаемые в реакциях N 1 .короткие двухнитевые фрагменты ДНК лигируют друг с другом следующим 55 образом: 10 мкл смеси и (ЕВХ 636 + EBI 656); 10 мкл смеси N 2 (EBI 660 + .EBI 638); 10 мкл смеси L 3 (EBI 643 +

EBI 646); 3 мкл 10 мИ АТР; 1. мкл

Xho I, 5 -. Старт

TCGAGTATACAATGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAA

САТАТСТТАСААССССТТТТСТССАССТССАТТ 20 лигазы ДНК (7 ед./мкл). Реакцию осуществляют в течение 15 ч при 4 С.

ДНК разделяют в 1 «ном агароеном геле и фрагмент ДНК длиной 128 п.о, выделяют. из геля путем .элюции.

Пример 12, Конструкция экспрессионных векторов. !

Плазмиду HS096 переваривают рестриктазами Xho Х и ХЬа I и вставляют в нее линкер длиной l28 п.о. {Xho Iмитохондриальный лидер - Xba Х) известным методом (рЕ022-А)! Ген чйп-Д, снабженный митохондриальной дрожжевой лидерной последовательностью ДНК, подвергают двойному перевариванию

Xho I и Есо RI и через Xho I — Есо RI вставляют в рКН1 (рЕ023"A).

Изготовленную таким образом экс" прессионную кассету вставляют аналогично примеру 8 через Bgl II/Hind III в дрожжевые трансформационные векторы.

YEpt3, pIDB207 и рЕАБ102 по сайтам

Bam НХ u Hind ХХХ.

Пример 13. Трансформация дрожжей и экспрессия в дрожжах.

Дрожжевой штамм и830-5g (пример 9) трансформируют полученными плаэмида.ми и трансформанты исследуют на их экспрессию (пример 10).

Штамм У$30-5g выращивают в культуре следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 6,7; глюкоза 1О; аргинин 0,16; лизин 0,25; триптофан

0,06„ метионин 0,08; цыстеин 0,03; гистидин 0,10; тирозин 0,16; фения-. аланин О, 17; треонин 0,16; иэолейцина 0,18; валин 0,21; глутаминовая кислота 0,40; глицин 0,21; цистеин

0,02; аланин 0,15; аспарагиновая кислота 0,20; пролин 0,20; серин

0,15; аспарагин О, 10; глутамин 0,20; аденин 0,025; урацил 0;050. Процесс выращивания осуществляют при аэрации до достижения оптической плотности 0,01 при 546 нм с использованием магнитной мешалки..

Основную культуру-состава: 8,0 г/

/л (ХБ !.) $04 2,56 г/л (NH4) НРОд.;

1,!6 г/л КС1; 0,60 г/Л ISO 7Н О;

0,56 гlл CaC1< ° 2HzO; 0,04 мг/л биотина; 80 мг/л м-инозита; 40 мг/л Сапантотената; 8 мг/л тиамина;

2 мг/л пиридоксина; 3,1 мг/л CuSO4 !!5Н О; 19 мг/л FeC1 6Н О; 12 мг/л

KnSOy 7Нэо; 14мг/л Ип$0! ° H

/л Н эО, 1 мг/л KI; 2 мг/л Нас igSOy!!

W2H<0; 1 г/л дрожжевого экстракта

0,2 г/л урацила; 0,1 г/л аденина;

174161 0,5 r/л литонной кислоты; 15 r/n

j глутаминрвой кислоты; 0,2 r/ë гистидина; 0,5 г/л триптофана; 100 r/ë глюкозы, получают в ферментере емкостью 20 л. В качестве инокулята используют Я количества предвари.тельной к мьтуры. Выращивание осуществляет аэрацией при размешивании (!00 об/мин) и постоянном значении 10 рН 5,0 при .28 С.

После снижения содержания глюко" эы до 50 г/л -еще раэ добавляют

50 r/h глюкозы и -продолжают ферментацию до тех пор, пока содержание 15 глюкозы не составит 10 г/л (пример-. но через 45 ч) охлаждают, центрифугируют и биомассу замораживают.

Выход биомассы 18 г/h влажных клеток, Пример 14. Получение .дрожже- 20 вых митохондрий.

Для того, чтобы установить приводит ли введение дрожжевой митохондриальной лидерной последовательности перед геном чйп-Д к импорту протеина в митохондрии изготовляют дрожжевые митохондрии и определяют активность 1п-Д в митохондриях и цитоплаэме.

Культуру выращивают путем встря- 30 хивания (300 об/мин) при 28 С в течеииа ночи, инокулируют в 225 мл среды YPD и выращивают в укаэанных условиях в течение ночи. После достижения оптической плотности 5 - 7 35 при 6000 нм клетки центрифугируют при

6500 еб/мин в течение 5 мин, Клетки промыввют ведой, суспендируют в 1 Мманнита, 20 мМ КР;:(КН РО4./К НРО ), рН 7,4, добавляют 1 мг/мл цимолаэы с мол.мас- 40 сой 500 и 2 ч встряхивают (50 об/мин) при 28 С, получая сферопласты. Их о центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, промывают раствором

1 М маннита, 20 мИ KP,, рН 7,4, мй 45 фторида Фенилметилсульфонила (ФФИС) .

Надосадочную жидкость удаляют и добавляют стеклянные шарики диаметром

0,1 мм в количестве, соответствующем

1 - 2 объема промытых клеток. 50

Клетки разрушают, суспендируют в 2,5 мл 0,65 М маннита, 1 мМ ЭДТУК, мМ ФФМС, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. Митохондрии выделяют из надосадочной жидкости путем центрифугирования при 12000 об/

/мин в течение 10 мин. Надосааочная жидкость содержит цитоплаэму и поэтому ее хранят с тем, чтобы потом

0 20 исследовать активность Ип-Й Краснокоричневый, центрифугат промывают буфером (белые цитоплазматические компоненты выливают) и затем митохондрии суспендируют в 2,5 мл того же буфера.

Загрязнения еще раз удаляют путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 5 мин. Митохондрии удаляют из насадочной жидкости путем повторного центрифугирования (при 122000 об/мин в течение 10 мин). Митохондрии разрушают при помощи стеклянных шариков и, используя активирующий гель,, их исследуют на содержание Ип-ig.

Пример 15. Очистка чйп-Д.

Стадия 1: разрушение клеток.

Клетки (пример 13) промывают в

1О мл дистиллированной воды на 1 г влажной массы и центрифугируют при

16000 об/мин в течение 15 мин. Осадок повторно суспендируют в натриевокалиевом фосфатном буфере (50 мМ, рН 7,0) при соотношении 1:3. Затем клетки разрушают в мельнице при помо" щи стеклянных шариков диаметром

0,1 мм при расходе 6 л/ч. Экстракт клеток центрифугируют в течение

15 мин (16000 об/мин 4 С) и осадок удаляют.

Стадия 2: осаждение полиэтиленимином.

К надосадочной жидкости первой стадии добавляют 54-ный водный раствор полиэтиленимина (pH 8,0) конечной концентрации 0,54. Затем продолжают размешивать еще в течение 30 мин и осадок удаляют центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30 мин. .Стадия 3: осаждение путем термообработки.

Надосадочную жидкость второй ста" дии при перемешивании нагревают до

60 С в водяной бане с температурой

80 С, находящейся в стальных стаканах. Затем в ледяной бане охлаждают до комнатной температуры. Выпавший протеин удаляют центрифугированием (10000 об/мин, в течение 10 мин при

4 С).

Стадия 4: осаждение сульфатом аммония, Надосадочную жидкость-стадии 3 насыщают сульфатом аммония до 204 и осадок отделяют центрифугированием (10000 об/мин в течение 15 мин при

4 С). Затем концентрацию сульфата аммония повышают до 90 и осадок

21 .отделяют центрифугированием (10000 об/мин в течение 15 мин при 4 С). а

Осадок поглощают в незначительном количестве (50 мИ, рН 6,0) буфера морфолиноэтансульфоната - 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (буфер ИЭС) и диализуют в течение ночи с использованием того же буфера.

Стадия 5: хроматография на катионите.

Колонку, содержащую катионит моно-S"ЯК 5/5 уравновешивают 5 объемами буФера ИЭС. Рослепода и экстракта на колонку несвязанные протеины промывают 5 объемами буфера ИЭС. Затем чйп-Д элюируют 20 объемами буфера

ИЭС с линейным градиентом от 0 до

50.мй NaC1. Фракции, содержащие активность Ип-Д, объединяют и диали" зуют с использованием натриево-калиевого Фосфатного буфера. (5 мй,рн 7,0).

Стадия 6: хроматография на гидроксилапатите.

На уравновешенную Фосфатным бу" фером (5 мй, рН 7,0) колонку гидрок-. силапатита подают диализат стадии 5 и чйп-Д элюируют 20 объемами натриево-калиевого фосфатного буфера с рН 7,0 с линейным градиентом от 5 до 300 мИ указанных солей. 3а степенью очистки чйп-Д наблюдают при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с использованием ДСЙ.

В результате очистки получают

21 мг (1, 16 .мг/клетки) чйпО -дисмутазы.

Пример 16. Характеристика чйп-Д.

Очищенную. чйп-.Я анализируют при помощи жидкостной:гельхроматографии под давлением, жидкостной хроматографии с обратной фазой под давлением, гельэлектрофореза с исподьзованием ДСН, нативного гельэлектрофореза и изоэлектрического фокусирования и сравнивают с естественной чйп — Д. а). Жидкостная гельхроматография под давлением. т

1741610

Колонка: Уотерс Протеин Пак Х

125,2Ф(7,8к300 мм), диаметр частиц геля 10 мкй; элюент: 0,5 И Na<804,, 0,02 И NaH

20, 253 пропиленгликоля; скорость подачи 0,5 мл/мин; детекция: погло- щение УФ, 214 нм.

5 !

О

I5

22

Естественная и получаемая предлагаемым способом чйп"Л показывает главный пик тетрамера энзима при мол. массе 70000 и 76000 соответственно, причем градуирование осуществляют с использованием четырех стандартных протеинов. б). Жидкостная хроматография с обратной фазой под давлением.

Колонка: -Бакербонд ВП С 8, 4,6х

4 250 мм, 5 мкм диаметра частиц, диаметр пор: 30 ; элюент А: О, 13-ная трифторуксусная кислота в воде; элюент Б: О,И-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле; .градиент:

203 Б в течение 2 мин, 20 - 683 Б в течение 24 мин, 683 Б в течение

10 мин, 68 - 20 Б в течение 1 мин; скорость подачи 1.,6 мл/мин; детекция: поглощение Уф, 214 нм и 280 нм.

Естественная и получаемая предлагаемым способом чйп-ДП проявляют время удерживания около 21 мин (20,7 и

20,9 мин, соответственно).

a). Гельэлектрофорез с использованием ДСН.

Разделительный гель - 153 акриламида; стекинг-гель " М акриламида; окраска серебром; величина геля

0,75 мм (8х10 см); режим: 60 мин, 150 а.

При подготовке проб для чИп-Д пробы смешивают с ДТТ в качестве восстановителя и кипятят. В геле ДСН обнаруживается мономер чйп-Д с мол. массой около 25000. а зависимости от степени полноты реакции восстановления можно доказать также наличие тетрамера с мол. массой около 90000. г). Нативный гельэлектрофорез.

Разделительный гель - 7,53 полиакриламидный гель, стекинг-гель — 23, акриламида + сахароза; величина геля 0,75 мм (8»0 см); режим,: 75 мин, 150 а; окрашивание кумасси голубым.

Получаемая после хроматографии на гидроксилапатите чйп-Д проявляет после электрофореза как после окрашивания кумассисиним (нанесенное количество чйа-,Д 0,3 мкг), так и после активирующего окрашивания о-диани зидином единую и находящуюся s том же положении полосу. д). Изоэлектрическое Фокусирование.

Пределы значения рН 3,5 — 9 5 гелевые пластинки LKB (1 ммх(9 л10 см); электродные растворы: 1 и фосфорная

10

Xho I - Рчи II

Старт

EBI 9fÓ 9 TCGAGTATACAATGTTGAGCCGCGCAGTGTGCCCCACCAGCAGCCACCTGCCTCCG

EBI 919 3. САТАТСТТАСААСТСССССССТСАСАСССССТССТССТСССТССАСССАССА

Lys

GTTTTGGGGTATCTGGGCTCCAGGCAGAAGCACTCTTTGCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT

CAAAACCCCATAGACCCGAGGTCCGTCTTCGTGAGAAACGGTCTGAACGGTATGCTGATGCCACGA

23 17416 кислота (анод), I М натриевый щелок (катод); температура охлаждения 7 С; объем проб 4,0 и 6,5 мкг соответственно; .режим: предварительное фоку" сирование 500 Вч; фокусирование

3000 Вч в целом,, окраска: кумассиголубой, о"дианиэидин.

В качестве изоэлектрической точки определяют р1 8,!5.

Пример 17. Конструкция кДНКгенобанка из печеночной ткани человека.

Аналогично примеру- 1 иэ свежей печеночной ткани (приблиэительйо 1 кг) выделяют РНК, получают:поли(А) РНК и синтезируют кДНК. Получение ф Вй!Огенобанка осуществляют аналогимно примеру

Пример 18. Использование гена ИпО -дисиутаэы в качестве ДНКзонда. а

I.

Полная кДНК гена Mn+-дисиутазы (пример б) используется в качестве ?5 радиоактивно маркированного ДНКзонда. 5 мг плазмидной ДНК HSOD6 гидролиэуют рестриктазами EcoRI u

Xho I, После разделяют в 1Ф-ном агароэйом геле иэ геля выделяют ДНК-фраг"30 мент с длиной 600 п.о., содержащий ген MnO+-дисмутаэы, его радиоактивно метят и используют в качестве

ДНК-зонда.

Реакционная смесь: 5 мкл 10«НИК трансляционного буфера; 1О мкл ДНКа

Фрагмента; 15 иклу(РЕГИСТР/ЗООО С (ммоль, водный раствор); 1 мкл 1 ий

dATP,; 1 мкл ТТР; 1 икл 1 мИ dCTP;

5 ед ДНК полимеразы 1; вода до, 50 икл.

10яНИК трансляционный буфер содержит 0,5 И трис-HCl, РН 7,2;

О,I м ИвЗО, 1 мИ дитиотреитола;

500 MKr/мл альбумина из сыворотки крупного рогатого скота.

Реакцию ведут в течение 1 ч при

14 С и прекращают добавлением 5 мкл

250 мИ ЭДТУК. Несвязанную радиоактивность удаляют на колонке с биогелем Рб-DG, В качестве злюента используют буфер ТЕ. Гибридизацию осуществляют согласно прииеру 3.

° Пример 19. Включение иитохондривльной человеческой лидерной

ДИК-последовательности ИпО -дисиутазы перед геном ИпОу-дисмутазы..

Совиестной гибридизацией двух . синтезированных олигонуклеотидов .(EBI 9!7,, EBI 9!9) получают ДНКфрагиент длиной 122 п.о. с Xho I/

/ХЬа X выступающими концами. Этот фрагмент соответствует приведенной в примере 6 Формуле ОП1, с той раз- ницей, что между стартовым кодоном

ATG и кодомом для лизина AAG вклю" чают человеческую лидерную ДНК-.последовательность.

ДНК-последовательность, содержа- щая вставку с человеческим генои

ИпО -дисмутазы, имеет следующую структуру.

Плазмиду HSOD6 гидролизуют рестриктазами Xho I и ХЬа Х :и вставляют линкер с длиной .122 п.о. (XhoI-человеческий.иитохондриальный лидер ;

ХЬа Х). Получает плаэмиду рКЙ22»А, переваривают ее рестриктазаии Xho Е

@ Eco RI (no 5 ед. мкг ДНК) и вставляют в РКН 1. Получают плазмиду рКН23-А.

Полученную таким образом экспрессионную кассету аналогично примеру

12 по сайтам ВВЕЕЕ/Hind ЕХХ(после двойного переваривания плазмид и

Табли ца 2 е еааааеюееееееююююююююеюююююююююеееюе

Вектор Получаемая плаэмида ююююеююеюеюе еююююеюе»юеюююеюеююееее

pIDB207 рКН24АВ

pEAS302 рКН25 АС

МЕР!3 рКН26» А

А ° выделения экспрессионной кассеты) вставляют векторы.Жр!3, pIDB207 и

pEAS!02 по сайтаи Bam HI u Hind Ш.,,В табл.Я указаны соответствующие плазмиды.

17!!1610

TG

EBI 1167

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA

GAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAÒ

TCAACTATTAAC

AGTTGATAATTGAGCT 5 ЕВХ 1160

Xho Х

Олигонуклеотидная пара и 2 (0L2) из ЕВХ 116!/EBI 1164 + EBI !159/ЕВХ 1168

Дрожжевой штамм У830-5В аналогич- Xho I-сайта. ЗРИ Х ХЬо Х-фРагмент, но примеру 10 .трансформируют зкс- содержащий стыковое место между прессионной плазмидой РКН 24-АВ. промотором и геном, заменяют олигоЭкспрессию плазмиды РКН2!!-AB в нуклеотидными парами для того, чтобы

5 штамме М830-5g подтверждают, исполь- удалить кодиРУющии Участок гена зуя методику примера 13.. ADHII и вставить правильный переход

Для подтверждения того, приводит к генУ Ил0 !-ДисмУтазы. Конструируют . ли введение дрожжевой митохондриаль-. 3 различные олигонуклеотидные пары ной лидерной последовательности перед !О OL1 ОХ-2 и 0Х*З аналогично пРимерУ 11 геном Ил0 -дисмутазы к тому что про- или 3б» котоРые незначительно отлиУ

Ф 1 теин вводится в митохондрии, получают чаются длинои Нукг еотиднои последодрожжевые митохондрии согласно при- вательности промоторной части. меру 14 и анализируют активность Согласно примеру 11 осуществляют

NnO -дисмутазы в митохондриях а так- !5 реакции гибридизации комплементарных и У де в цитоплазме. олигонуклеотидов:

Пример20. и ЕВХ 1161/БВХ 1164

Конструкция экспрессионной кассеты И 2 EBI 1167/ЕВХ 1160 с промотором ADHII (спиртовой дегид- Н 3 ЕВХ !!59/EBI 1168 рогеназы II) . И 4 EBI 1165/ESI 1166

В экспрессионной кассете РКН1 (пример 6б) промотор pDHI заменяют Синтезы EBI 1164, EBI 1167, EBI 1159, промотором ADHII no сайтам Xho I/ EBI 1165 и лигирование олигонуклео/Bam HI. Промотор ADHII выделяют из ™дов плазмиды AM 5 — ADH Х Х /В!Х . Плазмида 25 N 1 + И 2 = OL 1 рИИ 5-ADHII В/Х содержит фрагмент 1 + 3 = 0Х2

Bam HI/Hind III, содержащий промотор ! + ." = 0Х З

ADHII и имеющий участок гена ADHII с тем, чтобы получить три олигонук760 п.о. KcoRI-сайт рестрикции в леотидные пары OL1, OL2 и ОХЗ со начале кодирующего участка с помощью 30 следУющими ДНК-послеДовательноствми: линкера превращают в Xho Х-сайт рест. Олигонуклеотидная пара М 1(OL!) рикции, причем получают два Вав НХ" из ЕВХ 1!61/ЕВХ 1164 сайта, расположенные с обеих сторон

EBI !!6!

SpbI

5с

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTÑÀCÑÑTÑÀÒCGCÒGÀÀÀÀÀÀÑÒÑÒGÀÑ

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTCÒÒÑÒ

ТТТАТСАСААТСАТСАССАСАСААСААСАААЛАТАСТСААСААСААА

EBI 1164 5

EBI 116!

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

1741610

28

АААТАстсттАстАстастстсттаттстттттАТСАсттсттстттсттст тттАтсАОААтсАтсАссАОАсААсААсАААААТАсссААсААсААА

EBI 1164 5

TG

EBI 1159

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA

GAAGAACCATTTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGАТ

ТСААСТАТТААСТАТАТС

AGTTGATAATTGATATAGAGCT 5 EBI 1 168

Xho I

Олигонуклеотидная пара 11 3 (0L3) из EBI t16t/EBI tt64 + EBI 1165/

/EBI 1166

ЕВХ 1161

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTÑÒÒÑÒ

TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

Ф EBI 1164 т(, .

ADHII — промоторну о часть выде-, Т а б л и ц а 3 .ляют путем последовательного гидролиза рестриктазами переваривания Вектор + промотор Экспрессионная

Xho I u Bam НТ и вместо ADHI-промо- плазмида тора вводят в экспрессионную кассету

РКН1. В результате использования трех pIDB207-ADHII-ОЬ1 рЕ040

Различных олигонуклеотидных пар полу- pIDB207-ADHII-OL2 рЕ041 чают три различные экспрессионные pIDB207-ADHII-OLÇ . рЕ042 кассеты:

YEP13-ADHII-OL1 рЕ043 рКН1 - ADHII-ОЬ1 YEP13 ADHII-OL2 рЕ044

- рКН1 " ADHII-OL2 35 УЕР13-ADHII-ОЬЗ рЕ045 рКН2 — ADHII-ÎLÇ Дрожжевой штамм WS30-5g трансфорГФН М"02 -дисмутазы выделяют из мир ют эксп е мируют экспрессионнымвплазмидами, плазмиды РЕ022-А (пример 12) виДе указанными в табл.3 и продукты

40 транс ормации аналогично примеру во все тРи ADHII"ýêñïðåññîííûå .кас" 13 исслелуют на экспрессию. сеты. Снабженные геном Йп02 дисмутазы экспРессионные кассеты..Вырезают Конструкция эксп есси онструкция экспрессионной кассес помощью BgtII u Hind III и через ты с промотором тионеина/меди сайты рестрикции Bam HI u Hind ттт РомотоРом тионеинаУ е

45 лигированием вводят в дрожжевые Пр Сцр1 ромотор U аналогично примеру векторы pID207 и УЕР.1 3 аналогично 20 путем заме„ADHII примеру 8. путем замены ADHII-промотора встраивают в рКН1 по сайтам рестрикции Ваш НТ и Xho I. Дрожжевой

Дрожжевые экспрессионные плазмиды 50 промотор СБР1 лигируют с 8 олиго" с промотором ADHII приведены в нуклеотидами, синтезированными анатабл.3.

EBI 1691 логично примеру 3б или 11

8am HI

53

GATCCCATTACCGACATTTGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTA

TCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATATATGTGTATAGG

TTTATACGGATGATTTAATTATTACTTCA

EBI 1692

1741610

5I

СССТССТСААСТААТААТТАААТСАТСССТАТАААССТАТАСАСАТАТА

TGAGGAAAAATAATACAAAAGTGTTTTAAATACAGATACATACATGA

ACATATGCACGTATAGCGCCCAAATGTCGGTAATGG

ЕВХ 1696

ССАСССТТТАТТТСАСССТСАТАТСТТАСССТТСТТАСТАСТТАСАААААС

ACATTTTTGCTGTCAGTCACTGTCAAGAGATTCTTTTGCTGGCATTTCTT

EBI 1704

51

CTAGAAGAAATGCCAGCAAAAGAATCTCTTGACAGTGACTGACAGCAAA

AATGTCTTTTTCTAACTAGTAACAAGGCTAAGATATCAGCCTGAAATAA

А

EBI 1711

ХЬа I

51

CTAGAAGCAAAAAGAGCGATGCGTCTTTTCCGCTGAACCGTTCCAGCAAA

АААСАСТАССААСССААТАТССАТТСТСАСААТС АТАТААААСАСААС

CAAATAA

EBI 1710

5Ф

CAAGGAGTTATTTGCTTCTCTTTTATATGATTCTGACAATCCATATTÎÑGÒ

TGGTAGTCTTTTTTGCTGGAACGGTTCAGCGGAAAAGACGCATCGCTÑÒÒÒ

ТТССТТ

Xba

KBI 1716

СТССТТСТСТТСТАТСААТТССАТТАТЛАТАТСТТСТТСТТАСТССААТАТ

САТАТАСААСТСАТССЛААТАСАТАТТАЛСААААЛСАААСТСТАСАА

ТСААТСААТСЛАТСАТС

Xho I

Bam HI

САТСС ЕВЕ 1691 EBI 1696

ХЬа I

EBI 1711 EBI 1716

EBI 1692 EBI 1704 СТАС ЕВЕ 1710 EBI 1717 AGTC

3) лигирование олигонуклеотидов с олигонуклеотидами М 1 и 2, соглас- . но примеру 11; ДНК-Фрагмент элюируют из 2Ж-ного агарозного геля и по

65 сайтам Bam НŠ— Xba I Вводят s РЕБ102 . (пример ба). Получают плазмиду pE0 1b, Олигонуклеотиды Н 3 и 4 лигируют друг с другом, ДНК-Фрагмент элюируют из 2ь-ного агарозного геля и вводят .! осуществляют:

1) синтез олигонуклеотидов ЕВХ

1692, EBI 1704, EBI 1710, EBI 111б

2) реакции гибридизации олигонуклеотидов

1 EBI 1691/EBI 1692 и 2 EBI 1696/EBI 1704

У 3 EBI 1711/EBI 1710

И 4 EBI 1116/ЕВЕ 1717

EBI 1717 5 t

TCGAGATGATTGATTGATTGATTGTACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTAT

TTCGATGACTTCTATATGATATTGCACTAACAAGAAGATATTATAATGC

4,0 дущ достижения желаемого сочета- олигонуклеотидами EBI 1691/169 / ния CUP1-промотора с отдельными /1696/1704/1711/1710/1716 по схеме: рЕ051

ОЬ39:

51

AGCTTACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATA

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATG

OL40!

AAATGAGGATGCTCCTGGCTTTACTGAGCTGGGATATGGCTTAACCTTGGA

CCCTAGGTTTTCTGAAGACATTGCTTGTA

0L 4 I:

3f

GCCCTCCTGTTGCCTCTACTGGCAGCCCTAGTGATGACCAGCTATAGÑÑÑÒÑÒ

TGGATGTCTGGGCAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCGTACGACTACGÑÒGÑT

0L42:

gf

GTAGAGCACCGTAGTCGTAGGGCAGGTCGGGGAGGCTGTGCTTGCCCÀÑÀÑÀ

TCCAACAGGGCTATAGCTGGTCATCAGTAGGGCTGCCAGTAGAGGGAACAG

GAGGGGCATTGGG

/ХЬа I.,»-;.й»

11Ы1 III САР сайт.

gl

AGCTTACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCÀÒÀ

ATGTTCGTTACAGAAGTCTTTTGGATCCCAGGTTCCAATTCGGTAT лидер Я-Иф

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATGGCCCTCÑÒÑÒÒ

СС

AGGGTCGAGTCATTTCGGTCCTCGTAGGAGTAAAGGGTTACCGGGAGСАСА

31 17 161 по сайтам ХЬа Х - Xho I в рЕ046. По" лучают плазмиду рЕОч7. Теперь весь

СБР1-промотор можно лигировать. в рКН1 по сайтам Bam Н1 и ХЬо I, Получаемую экспрессионную кассету называют рЕ048, Ген Ип0 -дисмутазы выделяют из

° IlllRзмиды рЕ022-А (пример 12} с помощью рестрикции энзимами ХЬо Х и Есо PI и лигируют в экспрессионную кассету

pE0II8. Снабженную геном Nn0 -дисмута". зы экспрессионную кассету гидролизуют . рестриктазой BgIII и аналогично примеру 8 по сайтам Ваш HI e Hind III вводят в дрожжевые векторы рП)В207 и уяр13.

Дрожжевые экспрессионные плазмиды с СПР1-промотором приведены в табл.4. l аблица

Ф » °

Вектор Лидер Плазмида

« » «« »» » рХПВ207 дрожжевая pE050

ИпО -дисмуй

25 таза

VEP l 3 То we получают фрагмент ДНК длиной 192 п.о. с выступающими концами Нхпд III/

Дрожжевой штамм ИЯЗО-5g трансформируют аналогично примеру 13 экспрессионными плазмидами, указанными в табл.4, и продукты трансформации исследуют на экспрессию.

Пример 22. Экспрессия ИаО дисмутазы в эукариотических клетках животного происхождения. а). Конструкция экспрессионных плазмид, Ген ИпО - дисмутазы с помощью синтетических олигонуклеотидов снаб" жают на конце 5 соответствующими контрольными и лидерными последовательностями. Необходимыми контрольными последовательностями являются сайт САР и. стартовый сигнал ATG.

Для секреции в среде используют ли" дерную последовательность омегаинтерферона (В-Иф). Для внутрикле-. точной продукции используют человеческую митохондриальную лидерную последовательность ИпО -дисмутазы.

Путем сочетания четырех синтетических олигонуклеотидов ОЬ39 ÎL40„

0L41, 0L42, получаемых согласно примеру 3б или 11:

1741610

Hind III САР сайт.

gf

АССТТАСААССААТСТСТТСАСААААССТАСССТССААССТТААСССАТА

ATGTTCGTTACAGAAGTCTTTTGGATCCCAGGTTCCAATTCGGTAT старт лидера ИпО -дисмyтазы

TCCCAGCTCAGTAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCAATGTTGAGCCÑÑGC

А

AGGGTCGAGTCATTTCGGTCCTCGTAGGAGTAAAGGGTTACAACTCGGCCCGT

GTGTGCGGCACCAGCAGGCAGCTGCCTCCGGTTTTGGGGTATCTGGGCÒÑÑÀÑ

CACACGCCGTGGTCGTTCGTCGACGGAGGCCAAAACCCCATAGACCCGAGGT С.

Lys-старт протеина Мп0<-дисмутазы

ХЬа I

GCAGAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTGCT

CCGTCTTCGTGTCGGAGGGGGTGGACGGGATGCTGATGCCACGAGATС

AGG

CTCTACTGGCAGCCCTAGTGATGACCAGCTATAGCCCTGTTGG4TCTÑTGGG

GAGATGACCGTCGGGATCACTACTGGTCGATATCGGGACAACCTAGAGACC

С

-ys-старт Мп0<-дисмутазы

Xba I

CAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTGCT

GTTCGTGTCGGAGGGGCTGGACGGGATGCTGATGCCACGAGATC

Ф

Этот фрагмент ДНК представляет . аминокислот ИпО -дисмутазы (от лисобой 5 -нетранслируемый участок зина до аланина).

Я-Иф с .сайтом САР, стартовым сигна- Путем сочетания синтетических лом АТС,Я -Иф-лидерной последова- . олигонуклеотизов OL39, OL4O указантельностью (21 аминокислота) и ко- ;. ных формул и синтетических олигонукдирующий участок первых тринадцати леотидов OL43 и OL44

«Ф

OL43:

TTGAGCCGGGCAGTGTGCGGCACCAGCAGGGAGCTGCCTCCGGTTTTGGGGTA

TCTGGGCTCCAGGCAGAAGCACAGCCTCCCCGACCTGCCCTACGACTACGGTG

СТ

01.4Ч:

5с

CTAGAGCACCGTAGTCGTAGGGCAGGTCGGGGAGGCTGTGCTTCTGCÑÒGGÀ

GCCCAGATACCCCAAAACCGGAGGCAGCTGCCTGCTGGTGCCGCACAÑÒGCÑÑ

GGCTCAACATTGGG

Ф получают ДНК-Фрагмент длиной 196 п.о, /ХЬа I. с выступающими концами Hind ЕЕЕ/

Этот ДНК-фрагмент представляет собой часть нетранслированного 5 участка Я-ИФ с сайтом САР и старто- . вым сигналом ATG, а также с митохондриальной.лидерной последова" тельностью ИпО -дисмутазы человека (24 аминокйслоты) для внутриклеточ-. у ной продукции МпО -дисмутазы и кодирующего участка первых тринадцати аминокислот NnO<- дисмутазы.

Олигонуклеотиды OL39, OL42 и

OL44 фосфорилируют на 5 -конце при помощи Т4-полинуклеотидной киназы с тем, чтобы обеспечить осуществление последующей реакции лигирования.

Реакционная смесь: 2 мкл олигонуклеотида (100 пмоль)р 1 мкл 10хбу- . фер линкерной киназы; 3 мкл 10 мМ

АТР; 1 мкл. Т4-полинуклеотидной киназь!, 10 ед/мкл.

174

10<буфера линкерной киназы со» держит 0 „7 И трис-НС1, рН 7,6, 0,1 И, МдС1, 0,05 И дитиотреитола.

D.

Реакцию ведут 30 мин при 37 С, энзим инактивируют путем нагревания до 100 С, Олигонуклеотиды (И.40, 0L41 и 01.43, образующие 5 -концы готовых ДНКфрагментов, не фосфорилируют во избежание образования мультимерных

ДНК-вставок при последующей реакции лигирования.

Гибридизацию комплементарных олигонуклеотидов друг с другом осуществляют следующим образом:

Олигонуклеотиды А и Б представ" ляют собой комплементарные олиго" нуклеотиды.

Реагенты:

A = 01.39 Б = OL40

Р 2: А =OL41 .Б =OL42 3: A = 01.43 Б = 01,44

Реакционная смесь: l мкл олигонуклеотида A (100 пмоль).; 1 мкл олигонуклеотида Б (100 пмоль).;.8 мкл

aoR Реакционные смеси Р 1 - 3 нагревают при 100 С в течение 2 мин и медленно охлаждают в водяной бане до комнатной температуры.

Получаемые результаты реакций 1

3-короткие двунитевые фрагменты ДНК лигируют друг с другом следующим образом:

ПидерЯ-ИФ: 5 мкл реакционной смеси N 1; 5 мкл реакционной смеси и 2: 1,5 мкл/мл 10 мИ АТР; 0,5 мкл/

/мл ДНК-лигазы (7 ед/мкл).

Митохондриальная лидерная последовательность NnO<-дисмутазы: 5 мкл реакционной смеси M l; 5 мкл реак" ционной смеси У 3; 1,5 мкл 10 мИ АТР; .0,5 мкл ДHK-лигазы (7 ед ° )Реакции протекают в течение 15 ч к0 при температуре 4 С.

ДНК разделяют по размерам на

2ь "ном агароэном. геле и .желаемые

ДНК-фрагменты, длмной 192 и 196 п.о. элюируют из геля.

Готовый ДНК-фрагмент длиной. 192 п.о. с лидером Я-Иф -для секреции

NnO -дисмутаэы в среду. лигируют в

HQOD6 по сайтам Hind ХХХ и ХЬа Х.

Получают плазмиду. Н$0911. Плазмиду гидролиэуют .по сайтам Есо RI и обрабатывают фрагментом Кленова с обра" зованием тупых концов. Затем пере" вариваат Hind III и большой ДНК."

1610 36 фрагмент длиной приблизительно 700 п о. выделяют иэ 1,53-ного агарозного геля. ДНК-фрагмент лигируют в эукариотический вектор р$Ч2 gptdhfr, который получают из pBR 322 dhfr разрезанием Esp I u Hind. 11?, заполнением фрагментом Кленова и лигированием в вектор pSV2gpt по сайтам Есо RI—

Ваш HI, заполненным фрагментом Кле" нова и обработанным щелочной фасфата" зой, Лигирование выделившегося большо" го ДНК-фрагмента, имеющего приблизительно 700 п.о. в вектор pSU2gptdhfr осуществляют после предварительного гидролиза вектора с помощью Ара Х, заполнения сайта рестрикции фрагментом Кленова и дополнительного гидро«р лиза с .помощью Hind III . Òaêèè образом, ген gpt заменяют в векторе на ген МпО -дисмутаэы. Смесь лигирования используют для трансформации Е.со1ю.

НВ101, После рестрикционного анализа

«1 плазмидной ДНК положительных клонов получают экспрессионную плаэмиду, которую обозначают как pSV2dhfrSÎD1.

Аналогично ДНК-фрагмент с митохондриальным лидером МпО -дисмутаэы

ЗО длиной 196 п.о. по сайтам Hing ШХЪа1лигируют в HS016. Получают плазмиду Н$ОШ2. Ген с регуляторными последовательностями .клонируют в эукариотический вектор pSV2gptdhfr по сайтам рестрикции Hind Ш вЂ” Есо RI после предварительного заполнения выступающих концов Есо RI энэимом Кленова. Получаемую экспрессионную плаэми-. ду обозначают как р$Ч26Мг$002, Экспрессию р$Ч2ЙЫг$0Ш и р SV2dh f r SOD2 осуществляют в клетках

СН0 с дефицитом дегидрофолатредуктазы, которые культивируют в 0-ИЕИ-среде (103 эмбриональной телячьей сыворот-. ки, гипоксантин, тимидин). Трансфекцию клеток CHO экспрессионными плазмидами pSV2dhfrSOD1/D2 осуществляют известным образом. За день до трансфекции 7к10ь клеток подают на питательные пластинки.

Клетки обрабатывают продуктом осаждения фосфатом кальция, содержащим до 10 мкг плазмидной ДНК, при

37 С в течение 4 ч. Затем среду ото сасывают и заменяют селекционной средой g-МЕИ, содержащей 1 ОФ эмбриональной телячей сыворотки, которую каждые два дня заменяют. Колонии трансформированных клеток появляются

С С С

20 5 TGITA TT ТС TCIGTIACITT 3

Т.Т Т

А .С .А

5 TCIGTIAC TT ТСССА ТТТАТ 3

С Т G

31 17416 по истечении 12 - 16 дней. Надосадочную жидкость (среду) исследуют на наличие активности МпО -дисмутазы

Пример 23. Очистка МпО "дисмутазы. а) Разрушение клеток.

Аналогично примеру 15 клеточную массу промывают дистиллированной водой и в концентрации 303 суспенди- 10 руют в 50 мИ трис"уксусной кислоты, рН 8,5. Клетки разрушают в мельнице, содержащей стеклянные шарики диаметром 0,45 " 0,5 мм. Экстракт клеток центрифугируют (16000 об/мин, 15 мин, 4 С и осадок удаляют). б) Осаждение нагреванием и кислотой.

Надосадочную жидкость со стадии

"а" нагревают до 60 С, в ледяной бане охлаждают до 20 С, добавлением

1 И уксусной кислоты рН среды устанавливают до 5,5, центрифугируют при

16000 об/мин и подвергают диализу с помощью трис-уксусной кислоты И (60 мИ, рН 5,5) . в) Катионообменная хроматография.

Содержащий МпО -дисмутазу диали" зат со стадии "б" подают на колонку с СИ"сефарозой; уравновешенную 60 мй трис-уксусной кислотой, рН 5,5, злюируют линейным градиентом (15 объемов колонки) от 60 мИ трис-уксус,.ной кислоты до 0,12 И ацетата натрия.

r) Гельпроникающая хроматография, Фракции с активностью Мп0<-дисму35 тазы со.стадии "в" собирают и подают на колонку, содержащую сефакрил S

300 HR или суперозу 12, уравновешенную О,! И фосфатным буфером, рН=7,8.

10 . 38

Элюцию проводят тем же буфером.

Получают 20 мг (1,1 мг/г клетки)

> чИпО -дисмутазы.

Формула изобретения

Способ получения человеческой

МпО "дисмутазы, заключающийся в том, что из плацентарной или печеночной ткани человека выделяют мРНК, получают поли(А)" РНК, синтезируют двунитевую кДНК, конструируют генбанк кДНК, далее выделяют последователь" ность ДНК, кодирующую Mr. О-дисмутазу, при помощи зондов: или последовательности кДНК гена УпО<дисмутазы человека, последовательность ДНК достраивает до стартового кодона или. стоп-кодона, непосредст; венно за стартовым кодоном гена размещают митохондриальную лидерную или сигнальную последовательность

PHK HnO<-дисмутазы S.eerevisiae или человека, затеи последовательность r

ДНК, кодирующуя Ип0<-дисмутазу, используют для конструирования ввктора экспрессии, состоящего из промоторов АЭНТ или АВНТТ,.пар олигонуклеотидов EBI 1161/EBI 1164 + EBI 1167/

/EBI 1160 формулы

EBI 1161

Sph I

51

CCTATCACA7ATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

СТАСССАТАСТСТАТАТТТАТСТСАСССТСЬТСССТСААЛАААСТСТСАС

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTСТТСТ

TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAAATAGTGAAGAACAAA

EBI 1164 5

TG .EBI 1167

5>

СТАААТАСААТАТСААССТАСАААААССАТАСААТСААСТА

GAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAÒ

ТСААСТАТТААС

AG lGATAATTGAGCT 5 ЕВХ 1160

40

1741610 Xbo I

ЕВХ 1161/EÂI 1164 + EBI 1159/EBI 1168 формулы

EBI 1161

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTÑÒÒÑÒ

TTTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAMTAGTGAAGAACAAA

ЕВТ 1164 5

TG

EBI 1159

GTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAACTA

GAAGAACCATTTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT

TCAACTATAACTATATC

AGTTGATAATTGATATAGAGCT 5 EBI 1168

xh0 I

EBI 1161/EBI 1164 + EBI t165/EBI 1166 формулы

EBI 1161

5!

CCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCG

GTACGGATAGTGTATATTTATCTCACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAG

С

AAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTÑÒÒÑÒ

ТТТАТСЛСААТОАТСАССАСАСЛАСЛАСЛААААТАСТСААСЛАСЛАА

EBI 1164 5

ТС

EBI 1165

СТЛААТАСАЛТАТСЛЛССТАСЛЛАЛАССАТАСААТСААСТА

GAAGAACCATTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTTGAT

ТСЛАСТЛТТЛАСТАТАТССТААТАС

AGTTGATAATTGATATAGCATTATGAGCT 5 EBI. 1166

Xho

1 или рЕ042, или рЕ043, или рЕО44, или рЕ045, или pB)50, или рЕ051, которой трансформируют втаммы Sacchazomyces

cerevisiae, или плазмиду pSU2dhfrS0Dt или рБЧ20Ыг$092, которой трансформируют штаммы культивируемых клеток, культивируют трансформированные клетки, выделяют и .очищают целевой про» дукт путем .экстракции, осаждения и хроматографии. или CUPI, сигнала инициирования, митохондриальной лидерной или сигнальной последователь- ® ности $accharemyces cerevisiae или человека, стоп-кодона и терминатора

ADHII„ далее конструируют плазмиду . рУБ550Л, или рИ$490А, или pM$491A. или рИБ371Л, или рЧБ372Л, или р0$373Л, 4 или рЕ024 - AB,. или рЕ025 - AC, или

qE026 - AD, или рЕ040; или рЕ041, Составитель Т.Забойкнна .

Техред И.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Редактор Л.Пчолинская

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 2094 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5