Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов

 

Использование: биотехнология и ветеринария . Сущность изобретения: новорожденного теленка взвешивают и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении . Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы до первой выпойки теленку молозива. Масса тела новорожденного , осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, составляет не менее 25 - 27 кг. Объем извлекаемой крови не должен превышать 15 - 17 мл на 1 кг живой массы теленка. После формирования сгустка сыворотку отделяют центрифугированием. Содержание -глобулина в сыворотке не превышает 2%. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 5/00, А 61 К 35/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, (21) 4847534! 13 (22) 09.07.90 (46) 23.06.92. Бюл.%23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (72) Л.П.Дьяконов, Г,M.Ñòðoêèíà, Н.К.Расторопов, Е.В.Майджи, Н.И,Матюгина и B,А.Зубцов (53) 615,373 (088,8) (56) Авторское свидетел ьство СССР

N 015894, кл. А 61 К 35/16, 25.06.81, Сыворотка крови телят коров жидкая для культур клеток, Регламент производст- . ва, 1989.

Изобретение относится к ветеринарной клеточной биотехнологии, в частности к способу культивирования клеток животных и человека ин витро.

В биотехнологии клеток и тканей животных имеют широкое применение сыворотки крови, которые служат одним из компонентов питательных сред тканевых культур. Требования к сывороткам возросли в связи с широким использованием в ветеринарии, медицине, гибридомной биотехноло. гии, а также проведением исследований по генетической трансформации клеток.

Цель изобретения — повышение пролиферации клеток и увеличение накопления вирусов.

Поставленная цель достигается посредством того, что кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее., Ж, 1742323 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ

КРОВИ ТЕЛЯТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

КЛЕТОК И ВИРУСОВ (51) Использование: биотехнология и ветеринария, Сущность изобретения: новорожденного теленка взвешивают и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении. Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы до первой выпойки теленку молозива. Масса тела новорожденного, осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 — 1 0 ч после рождения, составляет не менее 25 — 27 кг.

Объем извлекаемой крови не должен превышать 15 — 17 мл на 1 кг живой массы теленка.

После формирования сгустка сыворотку отделяют центрифугированием. Содержание у-глобулина в сыворотке не превышает 27.

25 — 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 — 1,0 ч после рождения, в объеме 15 — 17 мл на 1 кг живой массы.

После обработки пуповины теленка взвешивают, переводят в помещение для взятия крови и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении на специальном столе. Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы в стерильные флаконы емкостью 250 — 1000 мл. Флаконы с кровью оставляют на 3 — 4 ч при 20—

35 С для формирования сгустка, после чего помещают в холодильную камеру (температура 6 С) на 12 — 24 ч, где происходит ретракция сгустка и отстаивание сыворотки. При наличии центрифуги через 1 — 2 ч отстоя флаконы с кровью помещают в центрифужные стаканы и. центрифугируют 30—

1742323 ния в присутствии предлагаемой сыворотки не отличается от величины эффективности клонирования при использовании эмбриональной сыворотки; культивирование перевиваемой культуры клеток J-96— сравнительный анализ данных по морфоло40 гии, цитохимии и чувствительности к вирусу щелочной фосфатазы и чувствительность к вирусу Коксаки ВЗ, клетки образуют хороСоставитель В. Свиридова

Редактор И. Дербак Техред М.Моргентал Корректор Н. Ревская

Заказ 2261 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

45 мин при 1,5 тыс, об/мин (известная методика).

Сыворотка крови новорожденных телят до первой выпойки молозива контролируется по следующим показателям: общий белок 5

35"=15 г/л, содержание у-глобулинов не более 2% от общего количества белка, содержание свободного гемоглобина не более

0,5 г/л.

Пример 1. Родившийся теленок осу- 10 ществил рефлекс стояния на ногах втечение

45 мин, имея массу 27 мг. От него получают

405 мл крови,. выход сыворотки 50, т.е.

200 мл сыворотки. Содержание у-глобулинов 1,2%, Сыворотку используют для куль- 15 тивирования: суспенэионного штамма перевиваемой почки свиньи (ППС), при этом эффективность клонирования 50 — 60%, плотность популяции 7 — 8.10 кл/мл среды, время уд- 20 воения популяции 27 — 30 ч; контроль — телячья сыворотка, 20 — 35%, 4 — 5 10 кл/мл, 30- 35 ч соответственно; при культивировании перевиваемой линии клеток FLK-BLV (почка эмбриона овцы), хронически инфици- 25 рован ной вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) .— индекс пролиферации

5,1 5,2, время формирования монослоя 3—

4 дня, титр выделенного антигена ВЛ КРС

1:20; контроль — телячья сыворотка, 4,5, 4 — 30

5 дней, 1:2 — 1:10 соответственно; контроль — эмбриональная сыворотка, 5,2, 3 — 4 дня, 1:20 соответственно; при культивировании стромальных клеток костного мозга в монослое — эффективность клонирова- 35 показал, что культивирование клеток с добавлением предлагаемой сыворотки не изменяет их морфологию, активность 45 ший сплошной монослой и выдерживают без смены среды 7 сут культивирования, как и в контроле (эмбриональная сыворотка).

Пример 2. От теленка весом 30 кг получают 450 мл крови, выход сыворотки

50%, т.е. 225 мл с содержанием у-глобулинов 1,1%.

На этой сыворотке культивируют культуры клеток легкого эмбриона коровы и перевиваемой линии клеток, при заражении

- которых короновирусом титр вируса составляет на 1,5 — 2,2 Ig выше, чем при заражении аналогичных культур, выращенных на телячьей сыворотке.

Сыворотка крови новорожденных телят до выпойки молозива для культивирования клеток и вирусов по своим биологическим и физико-химическим свойствам аналогична эмбриональной сыворотке, по рост-стимулирующим свойствам превосходит сыворот:ку крови телят.

Предлагаемый способ получения сыворотки позволяет сохранить жизнь теленка с последующим нормальным развитием.

Сыворотка крови новорожденных телят, полученная по предлагаемому способу, может быть применена в биотехнологии культивируемых клеток животных и человека, для удовлетворения потребностей ветеринарной, медицинской и биологической науки, а также биопроизводства вирус-вакцин, диагностикумов, других биологических препаратов.

Формула изобретения

Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов, включающий взятие крови, отделение сыворотки, контроль содержания у-глобулинов, о т л и ч а ю щ и й..с я тем, что, с целью повышения пролиферации клеток и увеличения накопления вирусов, кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее 25 — 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0.,3 — 1,0 ч после рождения, в объеме 15 — 17 мл на 1 кг живой массы.