Способ получения препарата митохондрий головного мозга

 

Использование: экспериментальная медицина , биология, биоэнергетика, фармакология . Ткань головного мозга хранят в среде выделения, насыщенной газовой смесью, состоящей из 4% кислорода, 8% углекислого газа и 88% азота. Все операции по выделению и хранению митохондрий проводят в среде, насыщенной этой смесью. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕ.ТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)s А 61 К 47/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСК0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4855106/14 (22) 31.07.90 (46) 07.07.92. Бюл. N 25 (71) Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра

АМН СССР (72) В.А. Хазанов и А.Н. Поборский (53) 612.015(088,8) (56) Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом, — M.: Наука, 1973, с, 106 — 129.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучению энергетического метаболизма.

Известно, что энергозависимые реакции митохондрий (MX) зависят от парциального давления кислорода и углекислого газа в окружающей органеллы среде. Традиционно выделение МХ и исследование их дыхательной активности проводят в гипероксической, по сравнению с внутриклеточной, среде, насыщенной воздухом.

Однако, данный способ обладает недостаточной точностью, так как в нем не учитывается регуляторная роль кислорода, как субстрата, в реакции образования ингибитора сукци натде гид роге назы-оксалоацетата, токсическое действие кислорода на сульфгидрильные группы тиоловых фермен- тов митохондрий, в частности дегидрогеназ и АТФ вЂ” аз, не учитывается влияние рСОг, а известно, что от его уровня зависит интенсивность процессов карбоксилирования и .. Я2 1745258 Al (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА (57) Использование: экспериментальная ме-. дицина, биология, биоэнергетика, фармакология, Ткань головного мозга хранят в среде выделения. насыщенной газовой смесью, состоящей из 4% кислорода, 8% углекислого газа и 88% азота. Все операции по выделению и хранению митохондрий проводят . в среде, насыщенной этой смесью. 2 табл, декарбоксилирования, состояние карбонатной буферной системы.

Целью изобретения является повышение качества MX препарата.

Цель достигается путем продувки газовой смесью определенного состава среды выделения МХ.

° юВ

Отличительные признаки проявляют в предлагаемой совокупности новые свойства, что приводит к достижению нового положительного эффекта у предлагаемого решения, Применение нармоксических условий исследования дыхательной активно- . (Я сти МХ мозга позволяет, с одной стороны. 00 полнее сохранить нативное состояние органелл и, с другой -- более дифференцирован- > но оценить градации их метаболических состояний.

Способ осуществляется следующим образом.

П-р и м е р 1. Для опытов используют белых крыс линии Вистар. Головной мозг после декапитации животного быстро извлекают и помещают на 10 мин в сосуд с

1745258

15

55 охлажденной до О С и предварительно продутой газовой смесью (кислород 4, углекислый гаэ 8%, азот 88%) средой выделения. Продувку осуществляли под контролем гаэоанализатора до полного насыщения среды, что соответствовало парциальному давлению. кислорода и углекислого газа 30 и 60 мм рт.ст, соответственно. Состав среды выделения: сахароза 0,3 М, HEPES 10 мМ, ЭДТА 0,2 мМ; рН 7,4, После охлаждения мозг. освобожденный от оболочек и сосудистых сплетений, продавливают через пресс с тонкими фильерами и гомогенизируют в пятикратном объеме среды выделения при постоянной продувке гомогената газовой смесью в термостатируемом тефлонстеклянном гомогениэаторе, Полученный гомогенат переливают в предварительно продутые газовой смесью центрифужные пробирки и герметично закрывают их крышками.

МХ выделяют методом дифференциального центрифугирования при температуре 0 С.

Полученную грубую митохондриальную фракцию суспендируют в среде выделения до концентрации белка 50 мг/мл при постоянной продувке газовой смесью. Готовую для работы суспензию хранят на льду в герметически закрытой, заполненной газовой смесью и роби рке.

Дыхание MX регистрируют полярографически при 26 С по изменению содержания кислорода в среде инкубации.

Насыщенная газовой смесью среда инкубации содержит сахароэу 0,17 М, HEPES 10 мМ. ЭДТА 0,2 MM, KCI 40 мМ, КН2Р04 5 мМ, КНСОз 8 мМ; рН 7,4. Использованные в качестве субстратов дыхания янтарная кислота 5. мМ и ее смесь с активаторами сукцинатдегидрогенаэы (СДГ) В-оксибутиратом и а-глицерофосфатом йо 3 мМ (указана концентрация в среде инкубации), а также раствор АДФ насыщают в период работы указанной газовой смесью.

Результаты исследования дыхательной активности органелл в 3 и 4 метаболических состояниях по Чансу приведены в таблице 1, В качестве контроля даны показатели дыхания МХ, выделенных аналогичным способом, на средах, уравновешенных по газовому составу с воздухом (гипероксия), т.е. в общепринятых условиях изучения функционального состояния органелл. Как при окислении одного сукцината, так и сукцината в присутствии активаторов СДГ отмечалось существенное различие величины всех показателей дыхательной активности МХ> за исключением коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/0) в нормоксических и гипероксических условиях. Отмечено возрастание в нормоксии на 40-70 скоростей дыхания органелл во всех метаболических состояниях, увеличение на 100 диапазона дыхательной активности и снижение на 40% времени фосфорилирования.

Применение активаторов СДГ способствовало контрастированию различий состояния МХ в исследуемых условиях инкубации. Так, в нормоксических условиях еще больше возрастали скорости дыхания органелл, расширялся диапазон их функциональной активности на фоне снижения времени фосфорилирования. Очевидное ингибирование дыхательной активности MX в гипероксии, сопровождающееся сужением диапазона функциональной лабильности, при неизменной степени сопряженности процессов окислительного фосфорирования можно объяснить известными закономерностями ингибирования тиоловых ферментов, в частности, дегидрогеназ и

AT-.àç, кислородом и развитием торможения

СДГ оксалоацетатом. Несомненно, что подобные глубокие и труднообратимые изменения состояния системы митохондриального окисления небезразличны при .анализе тонких градаций функционального состояния органелл.

Таким образом, положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в том числе в повышении точности исследования за счет снижения токсического влияния кислорода на тиоловые ферменты MX u уменьшения накопления в органеллах ингибитора СДГ оксалоацетата.

Пример 2. Применение предлагаемого препарата митохондрий для оценки состояния системы знергопродукции головного мозга крыс при циркулярной гипоксии и профилактическом введении препарата эмоксипин. В опытах используютбелых крыс самцов линии Вистар, Циркуляторную гипоксию мозга вызывают двусторонней окклюзией сонных артерий, Эмоксипин в дозе

5 мг/кг вводят внутрибрюшинно эа 50 мин до ишемии.

Через 3,5 ч после начала ишемии животных декапитируют и получают препарат митохондрий мозга способом, описанным выше. В качестве контроля служили митохондрии мозга интактной группы животных, выделенные и исследуемые по методам прототипа и предлагаемого соответственно.

Оценивали скорости фосфорилирующего дыхания органелл с последующим расчетом вклада окисляемой эндогенной янтарной кислоты при утилизации субстратов малат и глутамат (по 3 мМ) отдельно, а также в при1745258

Таблица 1

П р и м е ч а н и е: Ч4п, Ч, Чь-скорости дыхания МХ до, во время и после фосфорипирования в ммк AT 0/мин мг белка;

АДФ/О-козфициент сопряженности окислительного фосфорилирования;

Tp — время фосфорилирования в сек/мг белка.

*- различия с прототипом (гипероксия) достоверны при р<0,05. сутствии ингибитора трансаминаз аминооксиацетата (AOA) 1 MM и активаторов сукцинат-зависимого дыхания P -oêñèáóòèðàòà (p-OM) и а-глицерофосфата (а -ГФ) (no

3 мМ). Вклад окисления эндогенной янтарной кислоты в уровень дыхательной активности митохондрий рассчитывали как разницу скоростей фосфорилирующего дыхания органелл при утилизации субстратов в присутствии AOA и активаторов СДГ и без последних. Результаты приведены в таблице 2.

Видно, что исследуемый показатель уровня окисления эндогенной янтарной кислоты (ЭЯК) в предлагаемом препарате митохондрий мозга превосходит в известном на 120 g при изучении энергопродукции мозга животных, перенесших ишемию, и на 186 в группе, получавшей с профилактической целью препарат змоксипин. В группе интактных животных, как видно из таблицы, различия отсутствовали. Известно, что величина вклада эндогенной янтарной кислоты в уровень дыхательной активности митохондрий отражает характер адаптивных процессов в системе энергопродукции и является весьма информативной при оценке функционального состояния органелл. Маскировка величины этого показателя в известном способе, связанная с гипероксическими условиями эксперимента не только снижает точность исследования, но и может приводить к качественно иным результатам, формируя ложное суждение относительно реального состояния объекта; в группе прототипа исследуемый показатель снижается относительно уровня контроля, а в препара- . те, исследуемом предлагаемым способом, повышается.

Таким образом, полученный по предла5 гаемому методу препарат обладает более . высоким качеством эа счет того, что дополнительная продувка газовой смесью сред, субстратов, и суспензий митохондрий предотвращает окисление сульфгидрильных

10 групп тиоловых ферментов, Результаты дыхательной активности

MX мозга крыс в нормо-и гипероксических условиях эксперимента приведены в табл,1.

Результаты расчета скорости фосфорилиру15 ющего дыхания органелл приведены в табл,2.

Формула изобретения

Способ получения препарата митохондрий головного мозга путем извлечения голо20 вного мозга, помещения его в среду выделения, гомогениэации, центрифугирования, отделения митохондрий и их ресуспендирования в среде выделения, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения

25 качества препарата, эа счет увеличения скорости окисления субстрата и снижения времени фосфорилирования при сохранении величины дыхательного коэффициента

АДР/О, среда выделения предварительно

30 продувается газовой смесью, содержащей

4 кислорода, 8 углекислого газа и 88% азота, до полного насыщения среды.

1745258

Таблица 2 ()

П р и м е ч а н и е. — различия в паре (гипероксия/нормоксия) статистически достоверны при р<0,05; n=5.

Составитель А.Агуреев

Редактор И,Ванюшкина Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Т,Палий

Заказ 2340 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101