Способ получения субъединичной вакцины вируса простого лишая

 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и унификация вакцинного препарата. Для приготовления вакцины используют гликопротеин дВ, выделенный из клеток, предварительно зараженных вирусом простого лишая (ВПЛ): гликопротеин очищают методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител против дВ. Гель с адсорбированными антителами уравновешивают фосфатным буфером PH 7,2 - 7,4, содержащим 0,05 об. % простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. После адсорбции дВ гель промывают тем же буфером и элюируют гликопротеин раствором, содержащим ЗМ раствор тиоцианата калия и 0,05 об.% простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. Полученный очищенный препарат дВ диализуют против фосфатного буфера и адсорбируют на гидроксиде алюминия. Вакцину можно лиофилизировать, она эффективна против ВПЛ 1 и П типа.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 А 61 К 39/12, 47/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3786918/30-!3 (22) 30.08.84 (31) 159641 (32) 31,08.83 (33) JI (46) 30,03.90. Бюл. М 12 (7l) Джуридикал Фаундей|пн Дзе КемоСеро-Терапевтик Рисерч Институт (JP) (72) Еитиро Кино и Нобуя Охтомо (JP) (53) 615.372 (088,8) (56) The Human Hегоes Viruses. Ed. by Nahmias et al. Elsevier, New York, 1981, р,р, 503-509, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЬЬВДИНИЧНОИ

ВАКЦИНЫ ВИРУСА IIPOETOГО ЛИ!ЧАЯ (57) Изобретение относится к вирусо- . логии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов, Цель изобретения — повышение чисToThl целевого продукта и унификация вакционного препарата, Лля приготов-3

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов, Цель изобретения — повышение чистоти целевого продукта и унификация вакцинного препарата, П р и и е р 1. Приготовление моноклонального антитела.

Клетки Veto, зараженные KOSштаммом вируса простого лишая (ВПЛ) типа I, через 24 ч после заражения растворяют в фосфатном буферном растворе рН 7,2-7,4, содержащем 1 об/об.7. простого полиоксиэтиленоктилфенило„„SU„„1554755 A 3

2 ленин вакцины используют гликопротеин gB, выделенный из клеток, предварительно зараженных вирусом простого лишая (В!1Л): гликопротеин очищают методом аффинной хроматографии с ис.пользованием моноклональных антител против 8В. Гель с адсорбированными антителами уравновешивают фосфатным буфером рН 7,2-7,4, содержащим 0,05 об.7 простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. После адсорбции 8В гель промывают тем же буфером и элюируют гликопротеин раствором, содержащим ЗМ раствор тиоцианата калия и 0,05 об,7 простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира °

Полученный очищенный препарат gB диализуют против фосфатного буфера и адсорбируют на гидроксиде алюминия, Вакцину можно лиофилизировать, она эффективна против ВПЛ Т и II типа, ного эфира (тритона Х-100), пр1 4 С в течение 1 ч, Полученный раствор центрифугируют в течение 1 ч при

100 тыс. g и собирают супернатант, представляющий собои фракцию сырого гликопротеина О,! мл этой фракции (содержание протеина 100 мг/мп), вводят внутрикожно в заднкю лапу

4-недельным самкам мышей линии

HAI.Â/с. Через месяц после иммунизации у животных извлекают селезенку, нарезают ее на тонкие ломтики и cur.nåíäèðóþò в среде Игла MEM. Полученную суспензию клеток в концейт1554755

Очищенный 8Н подвергают электрофоретическому анализу с использоваHHBM Sl)S-полиакриламидного геля.

Основная полоса gB обнаруживается примерно при 9ОК.

Пример 3. Получение вакцины ия очищенного gB„

55 рации 1. 1О кл/мл и отдельно приготс1вленную суспенэию клеток P3HI в концентрации 1 10 кл/мл сливают в пробирку и добавляют полиэтиленгли

5 коль м,в. 4000, Реакцию слияния о клеток проводят при 37 С в течение

5 мин. Полученные гибриды клеток суспендируют в среде ГАТ, отбирая гибрид> способный продуцировать анти- 10 тела к рВ, Отобранный гибрид вводят внутрибрюшинно 4-недельным самкам мышей линии BALB/с обработанным

2,б-,10,14-тетраметилпентадеканом.

Через 7-14 дней после введения от- 15 бирают асцитическую жидкость и получают моноклональное антитело (монАТ), специфичное к gB (количество IgG !

0 мг/мл), Л р и м е р 2. Приготовление адсор-20 бента, связанного с монАТ

К полученной по примеру 1 асцитической жидкости, содеРжащей монАТ о добавляют при 4 С 50Х.-иый раствор сульфата аммония — для осаждения 25

IgG-фракции. Осадок иммуноглобулинов растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 M NaHCO и 0,15 М

NaCI рН 8,2 °

Полученный раствор подвергают 30 диалиэу против того же буферного раствора при 4ОС в течение 24 ч, после чего связывают его с активированной CNBr сефарозой 4В в концентрации 5 мг/мп. Получают связанный

35 с МднАТ адсорбент.

Очистка дВ с помощью иммусорбента, Клетки Vего заражают ВПЛ типа (КО-штамм) через 24 ч собирают зараженные клетки, растворяют их в фосфатно-буферном растворе рН 7,27,4, содержащем 0,05 o6/об тритона

Х-100, и пропускают через колонку, заполненную иммуносорбентом, Колонку промывают тем же буферным раст- 45 вором, Адсорбированный дВ элюируют

3М раствором I

0,05 o6/обХ тритона Х-100, диализуют против того же буфера и концентрируют ультрафильтрацией, Все операции о проводят при 4 С.

Раствор очищенного gB в фосфатнобуферном растворе рН 7, 2-7,4 с

0,05 o6/обХ тритона Х-100, содержащий 30 мкг/мп протеина, смешивают с водным раствором хлористого алюминия (в пересчете на гидрооксид алюминия — в 8-кратном . по весу избытке по сравнению с весом протеина 8B). рН смеси доводят lн раствором NaOH до 6,7, Получают гель гидроксида алюминия с адсорбироваваимся протеином gB, Полученный продукт центрифугируют, осадок диспергируют .в исходном буфере с таким расчетом, чтобы концентрация gB составляла

30 мкг/мл. К препарату добавляют тимерсал в количестве 0,0! вес,/о6.X.

Смесь разливают объемом 2 мп по 1 мл в каждую, ампулы эапаивают, В процессе хранения вакцины выпадает белый туманообразный осадок, при легком встряхивании образуется однородная белая суспензия.

Пример 4, Получение лиофилиэированной вакцины, Осадок алюминиевого геля с адсорбированным 8В, полученный по примеру

3, диспергируют в физиологическом растворе (рН 7,2-7,4), содержащем

10 вес.!о6.Х лактозы, 0,4 вес./об.Х

L-глутамината натрия,.0,4 вес./oá.Õ аргинина, 0,8 вес,/об.X желатина и

0,05 вес./об.Х тимерсала, концентрация протеина 30 мкг/мл, Вакцину с наполнителем разливают по 1 мп в ампулы емкостью ? мл и лиофилиэируют по схеме: предварительная лио" филиэация при -50OC и атмосферном давлении в течение б ч, затем первая лиофилизация при +5 С при пониженном давлении (0,04 Торр) в течение 15 мин и вторая лиофилизация при +30"С при пониженном давлении (0,05 Торр) в течение 8 ч. Получают лиофилизированную вакцину, При испытании адсорбированной вакцины H адсорбированной лиофилизированной вакцины на лабораторных животных установлено, что вакцины ареактогенны, нетоксичны и иммуногенны, Вакцина независимо от формы проявляет высокий защитный эффект

1ООХ-ная выживаемость животных) в отношении как ВПЛ Т. типа, так и ВПЛ

П.типа, Ф о р м у л а и з и 6 р е т е н и я

Способ получения субъединичной вакцины вируса простого лишая, вклюСоставитель Г.Смирнова

Редактор M,öèòêèíà техред И.дидык

Корректор В.Кабаций >

Заказ 466 Тираж 542 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина,101

5 1554755

6 чающий очистку раствора, содержащего буфером-рН 7,2-7,4, содержащим гликопротеины вируса простого лишая, 0,05 об.Х простого полиоксизтиленс помощью аффинной хроматографии октилфенилового эфира, промывку гепя с последующей адсорбцией целевого r. абсорбатом осуществляют тем же

5 продукта на алюмогеле, о т л и— буфером и элюнруют целевой продукт чающий ся тем, что, с целью элюирующим раствором, содержащим повышения чистоты целевого продукта 3М-раствор тиоцианата калия и и унификации вакцинного препарата, 0,05 об,X простого полиоксиэтиленаффинную хроматографию осуществляют 1О октилфенилового эфира, а перед адсорбпутем пропускания раствора через цией íà алюмогеле целевой продукт гель, связанный с моноклональным диализуют против буфера, используеантителом, специфичным к гликопро- мого для аффинной хроматографии. теину gH, и уравновешенный фосфатным