Способ определения амфотерицина в в крови
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
Р I 10" 3
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4812899/14 (22) 09.04.90 (46) 07.07.92. Бюл, ¹ 25 (71) Винницкий медицинский институт им.
Н.И.Пирогова (72) А.С.Азаров, А.В.Ильченко и С.B.Ñàíäåð (53) 615.475 (088,8) (56) Lec/årq M„Fouiliit M. ат al. I; Chrom, В!отесГ. Арр!., 1985, 337, № 2, р. 423 — 428. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМФОТЕРИ-.
ЦИНА B В КРОВИ
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования, и может быть использовано для количественного определения амфотерицина В в крови.
Известен ряд способов количественного определения амфотерицина В: микробиологический, хроматографический и спектрофотометрический.
Однако, микробиологический способ обладает низкой чувствительностью (не выше 5 мкг/мл), требует для своего проведения большого количества высокочистых реактивов, специального микробиологического оборудования, высокой квалификации исполнителя и длятся до 2 сут, т.е. метод практически неприменим для серийных экспрессных биохимических исследований в условиях клиники, где требуется проводить контроль содер>кания препарата в крови в кратчайшие сроки с целью своевременной корректировки вводимых доз.
Для определения амфотерицина В используется высокоэффективная жидкостная хроматография на приборе с патроном
"Rad-Pak С-18 100 х 8 мм с УФ-детектором с,, Ы„„1746315 А1 (57) Использование: биохимические методы исследования.амфотерицина В. Цель — упрощение способа, повышение его экономичности, Сущность изобретения: пробу крови смешивают с 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, центрифугируют, инкубируют в темноте 2 ч при температуре
+5 С с последующим флуориметрированием. Положительный эффект: удешевление. упрощение способа, 5 табл.
Ф
l фильтрами 405 и 340. нм. Отношение поглощения при 405 и 340 нм используется для оценки содержания примесей.
Для определения пробу крови 500 мкл выдерживают 30 мин до ее свертыва- Я ния, затем пробу центрифугируют при
3000 об/мин в течение 10 мин с целью отделения сыворотки. 100 мкл сыворотки смешивают с 300 мкл подвижной фазы (смесь метанола с 5 мМ раствором ЭДТА с рН 7,8 в .(Ъ, . соотношении 80:20) и центрифугируют при 0, 6000 об/мин в течение 30 мин. Отбирается Ъ
100 мкл супернатанта, которые и подвергаются анализу в ВЭЖХ-хроматографе.
Чувствительность метода 0,05 мкг/мл, калибровочный график линии до 1,4 мкг/мл, степень открытия амфотерицина В в сыво-,Ф ротке 800/. При концентрации препарата
1.55 мкгlмл коэффициент вариации определения составляет 3% (при и = 10), Недостатком метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в данном случае является то, что для его осуществле- . ния необходим ВЭЖ-хроматограф — прибор ограниченной доступности, т.е, осуществить определение амфотерицина В методом
1746315
ВЭЖХ в клинических условиях практически Из табл, 1 следует, что для достижения невозможно. Кроме этого, этот метод требу- наибольшей чувствительности метода и поет использования особо чистых реактивов и стоянства результатов необходимо выдерматериалов, для работы на хроматографе жать смесь в течение 2-3 ч, необходимо иметь подготовленного специ- 5 Была определена зависимость флуоресалиста.
I ценции от условий инкубирования (освеЦелью изобретения является упроще- щенность, температура). ние способа и повышение его экономично- Раствор амфотерицина В с концентрасти. цией 3 мкг/мл приливают к 107„-ному расПоставленная цель остигается путем 10 твору ТХУ, причем было взято четыре серии определения флуоресценции амфотерици- пробирок по восемь штук в каждой серии, на В в среде трихлоруксусной кислоты Условия инкубирования: все серии инкубировали в течение 2 ч. Серия 1 — полная темо
Способ осуществляется следующим об- нота, температура 5 С, серия 2 — полная разом. 15 темнота, температура 20 С, серия 3 — полК пробе, содержащей амфотерицин В, ная темнота, температура 50 С и серия прибавляютрастворТХУ,центрифугируюти при солнечном освещении, температура после инкубирования определяют флуорес- 20 С, ценцию данного раствора. После инкубирования производят заПример. Реактивы:. раствор ТХУ в 20 мерфлуоресценции. Усредненные значения дистиллированной воде 10 . Ход определе- показаний измерительного прибора по каждой серии приведены в табл. 2.
К 1 ч. плазмы крови (0,5 мл) добавляют Очевидно, что оптимальным условием
10ч,(5мл)раствора TXY.Пробуинтенсивно для повышения чувствительности метода встряхивают в пробирке в течение 15 с, за- 25 является инкубация смеси в темноте при тем содержимое центрифугируют 10 мин пониженной температуре. Воздействиесвепри 3000 об/мин. Надосадочную жидкость та на инкубируемую смесь должно быть свепереливают в сухую пробирку и оставляют дено к минимуму. на 2 ч при 10 С в темном месте. Определяют Определена зависимость флуоресценфлуоресценцию данного раствора при дли- 30 ции раствора от концентрации ТХУ. в котоне волны возбуждающего света 383 нм и рой производится инкубирование. Для регистрации и ре страции при длине света 470 нм. В этого четыре серии образцов смешивались
1 качестве контрольного раствора использо- с растворами ТХУ с концентрацией 5, 0 20 вана смесь 5 мл 10 Я,-ного раствора ТХУ и и 507, Каждая серия включала восемь проб
0,5 мл плазмы крови в отсутствие препара- 35 с концентрацией 3 мкг/мл. После инкубирота, обработанная так же, как испытуемый вания в темноте при 10 С была измерена раствор. Концентрация амфотерицина В on- флуоресценция растворов, Результаты изределяется по градуировочному графику. мерений представлены в табл. 3.
С целью обоснования способа проведе- По результатам измерений можно сдены следующие исследования. 40 лать вывод, что увеличение концентрации
Определено значение максимума по- ТХУ свыше 10 Р приводит к снижению флуглощения света раствором амфотерицина оресЦенции раствора. Поскольку снижение
В. Определение произведено на спектро- концентрации ТХУ ниже 5 ухудшаетосажфотометре, Полученное значение равно дение белков из биологических жидкостей, 383 нм. 45 то оптимальной концентрацией ТХУ при опОпределена длина волны испускаемого ределении амфотерицина В в биологичесвета. Определение произведено на флуо- ских жидкостях можно считать 5-10%, риметре, в качестве регистрирующего при- Воспроизводимость предлагаемого бора использован цифровой вольтметр, способа определения амфотерицина В зашунтированный резистором 300 кОм. 50 изучена при параллельном определении
Полученное значение равно 470 нм. десяти проб, содержащих по 1,5 мкг преОпределена зависимость интенсивно- парата. Результаты определения приведести флуоресценции от времени инкубирова- ны в табл. 4. ния. Для этого смешивали 0,5 мл раствора Приведена пригодность метода для оппрепарата концентрацией 3 мкг/мл с 5 мл 55 ределения амфотерицина В в биологиче107ь-ной ТХУ и выдерживали в темном мес- ской жидкости — плазме. крови, Для этого в те втечение бч, Периодически производили двух параллельных сериях опытов опредеизмерение интенсивности флуоресценции лялось содержание препарата — в одном раствора. Полученные результаты приведе- случае препарат добавлялся в дистиллироны в табл. 1. ванную воду, в другом — к плазме крови, 1746315
Таблица 1
Таблица 2
Серия 4 . 10 +. 0,4
Серия 3
116 +4
Серия 2
280 +. 6
Серия 1
305 "-6
Таблица 3
50 100 +-.3
Концентрация ТХУ, g, Фл о есценция
300 6
150 + 4
300+6
Концентрация препарата в обоих случаях была равна и составляла 2 мкг/мл. Обработка каждой серии проводилась одинаково, в соответствии с примером выполнения определения. Результаты,.полученные в каждой 5 серии, совпадали. Таким образом, показана возможность определения амфотерицина В в плазме крови, так как последняя не содержит мешающих определению веществ.
Было показано, что градуировочный 10 график при определении амфотерицина В линеен в пределах 0,03 — 12 мкгlмл (исходная концентрация), что соответствует содержанию в пробе от 0,015 до 6 мкг.
B табл. 5 дается сравнительная характе- 15 ристика методов количественного определения амфотерицина В.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить затра20 ты времени на проведение анализа, значительно удешевить и упростить его, сделать более доступной возможность проведения анализа в клинической практике.
Формула изобретения
Способ определения эмфотерицина В в крови, включающий взятие пробы с последующим ее биохимическим анализом, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения экономичности, пробу смешивают с 10%-ным растворомтрихлоруксусной кислоты в соотношении
1:10, центрифугируют, инкубируют 2 ч в темноте при 5 С, флуориметрируют при длине волны возбуждающего света 383 нм и длине волны регистрации 470 нм, а концентрацию амфотерицина В рассчитывают по калибровочной кривой.
Таблица 4
П р и м е ч а н и е. Х вЂ”.среднее арифметическое; 0 — выборочная квадратичная ошибка; а — коэффициент вариации;  — доверительный интервал.
Таблица5
Составитель Н.Теренина
Редактор Н.Бобкова Техред M.Moðãåíòàë Корректор H.Êoðoëü
Заказ 2392 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, РаушскаФ наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101
