Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний. Цель изобретения - повышение точности способа. Определяемый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальция, и определяют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определяют концентрацию липополисахаридных антигенов. Способ позволяет повысить точность определения в 2-3 раза. 3 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N ЗЗ/52, 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ х 100%, (1) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4777248/14 (22) 05,01.90 (46) 15.03.92. Бюл. г» 10 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) С. Н. Скопинская, С. П. Ярков и В. Н.

Злобин (53) 612,015(088.8) (56) Власов П, С. и др. Журн. микробиологии и экспериментальной иммунологии, 1985, М

8. с. 81-91. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИГЕНОВ МИКРООРГАНИЗМОВ B СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют встраивание определяемого антигена (АГ) в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосомы, проведение реакции комплемент-зависимого лизиса с последующим определением АГ по выходу маркера из лизированных липосом.

Перед включением маркера определяемый

АГ обрабатывают 0,1 N щелочью при нагревании до 950С в течение 10 мин. В качестве маркера используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальцин. Определя,,5U,, 1720003 А1 агностике инфекционных заболеваний.

Цель изобретения — повышение точности способа. Определяемый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95 С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальция, и определяют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определяют концентрацию липополисахаридных антигенов.

Способ позволяет повысить точность определения в 2 — 3 раза. 3 табл. ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплемент-зависимого лизиса липосом с контролями и рассчитывают долю иммунного лизиса по выражению гдЕ F> — интенсивность флуоресценции суспензии липосом;

Fz — интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой стандартной антисыворотки и комплемента:

Рз — интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только стандартной антисыворотки;

1720003

10

20

45

55

F4- интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только комплемента;

Fs — интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного и комплемента;

Рв — интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного, комплемента, стандартной антисыворотки.

Концентрацию липополисахаридных антигенов определяют по калибровочной кривой.

Пример 1. Получение липосомального иммунореагента.

Раствор липидов — яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат(в малярном соотношении 2:1, 5:0,22) в смеси хлороформ, метанол(2:1 по объему) упаривают на роторном. испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора липополисахарида (ЛПС), предварительно обработанного 0,1 и йаОН и содержащего 175 мМ кальцеина.

Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц в течение 20-30 с. Полученную эмульсию упаривают на роторном испарителе до образования твердого геля при 35-45 КПа, а затем при 25 КПа до полного удаления эфира. Невключающийся маркер отделяют. гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Полученный липосомальный иммунореагент сохраняется при+4 С в течение 3 — 4 месяцев без утраты своей биологической активности.

Пример 2. Количественное определение содержания ЛПС в сыворотке крови больного.

В две пробирки вносят по 10 мкл сыворотки больного и по 20 мкл антисыворотки с разведением 1:32.

Через 10 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 40 мкл (60 нмолей липида) суспензии липосомального иммунореагента, дополнительно инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл триссолевого буфера, содержащего 5 мМ MgClz и 1,5 мМ

CaClz и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до 100 мклтрис-солевым буфером.

: Параллельно ставят контроли на неспецифический лизис липисом антисывороткой и исследуемой сывороткой больного в присутствии комплемента. lepea 30 мин реакции останавливают 3 мл трис-солевого буфера.

Флуоресценцию измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см или пробирке при длиНе волн эмиссии и возбуждения 493 и

520 нм соответственно.

Расчет величины иммунного лиэиса проводится по уравнению (1), при этом берутся средние значения двух параллельных измерений. По калибровочной кривой определяют содержание ОПС-антигена в мкг/мл, которое для трех образцов сывороток больных сальмонеллезом составило 0,7;

11,2; 29.5 мкг ЛПС/мл образца сыворотки крови больного.

В табл. 1 отражены результаты определения интенсивности флуоресценции и расчет величины концентрации и процента иммунного лизиса для трех различных сывороток больных с различными содержаниями соматического 0-антигена Яа! топе11а

fyphimurlum в сыворотке крови.

Пример 3. Повышение воспроизводимости и точности метода, Липосомы приготовили, как указано в примере 1, определение антигена проводят, как указано в примере 2. В табл, 2 приведены значения доли иммунного лизиса и концентрации антигена, определенного с одной партией липосом в сыворотке крови больного, что отражает воспроизводимость метода.

В табл. 3 приведены значения определения величин иммунного лизиса, соответствующего определенным концентрациям

ЛПС-антигена в растворе. Для проведения. анализа взяты приготовленные каждый раз заново партии липосомального иммунореагента, что отражает воспроизводимость метода.

Пример 4. Построение калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛПС S. typhimurutm в трис-солевом буфере. 10 мкл раствора ЛПС каждой концентрации смешивают с 20 мкл стандартной антисыворотки. Используют такое разведение антисыворотки, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Определяют иммунный лизис в тех же условиях, что ис образцами сыворотки больного. Ставят также контроли: липосомы только с буферным раствором, липосомы только с антисывороткой, липосомы только с комплементом. За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствие

ЛПС. Диапазон измеряемых концентраций от 0,5 до 200 мкл/ЛПС/мл исходного раствора. Строят кривую зависимости величи1720003

Таблица 1

Табл и ца 2 ны иммунного лизиса от логарифма концентрации ЛПС в растворе.

Предложенный способ позволяет в 2-3 раза повысить точность в сравнении с известным способом, 5

Изобретением может быть использовано в практике здравоохранения для экспрессдиагностики инфекционных заболеваний и определения тяжести их протекания контро- 10 ля загрязнения окружающей среды, в научноисследовательской практике для изучения динамики антигенемии при экспериментальном инфицировании животных.

Предложенный способ легко может 15 быть автоматизирован, требует малого (10 мкл) количества исследуемой сыворотки.

Формула изобретения

Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови, включающий встраивание антигена в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосом, проведение реакции комплементозависимого. лизиса с последующим определением антигена по выходумаркера, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа. липополисахариды перед встраиванием в липосомы обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95 С в течение 10 мин, в качестве маркера используют кальцеин, невключившийся маркер отделяют гельфильтрацией, а выход маркера определяют фл юо риметрически.

1720003

Таблица 3

Составитель Н.Гуляева

Техред М.Моргентал Корректор М.Кучерявая

Редактор И.Сегляник

Прои- водственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 769 Тираж Подписное

ВНИИПИ Гссударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5