Способ получения конъюгированного энтеротоксина еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения конъюгированного термостабильного энтеротоксина кишечной палочки. Сущность изобретения: культивирование токсигенных штаммов осуществляют на среде следующего состава, г/л: перевар Хоттингера 80-250; сернокислый магний 3,0-3.8: однозамещенный фосфорнокислый натрий 6,0-6,8; однозамещенный фосфорнокислый калий 3,0-3.8; глюкоза 5#-7,0; дистиллиро ванная вода до 1 л, отделяют токсиносодержащий супернатант, термолабильный и термостабильный токсины осаждают сульфатом аммония при разной степени насыщения , выдерживают преципитаты 18-20 ч при 2-4°С, центрируют осадки термолабильного и термостабильного токсинов, растворяют в дистиллированной воде и трис-HCI буфере соответственно и диализуют, после чего «х объединяют в соотношении 100:1 и конъюгируют глутаровым альдегидом до конечной концентрации 2 г/л, конъюгат диализуют сначала против фосфатного буфера, а затем против трис- HCI буфера, конъюгат растворяют в трис- HCI буфере, содержащем бычий сывороточный альбумин. 6 табл. Ън Ё

„„5U 1750690 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 39/108

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

3.:.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ чт к ч т

1 . :- -. :;,2 (21) 4788233/13 . : ноэамещенный фосфорнокислый натрий (22) 19;12.89 .: :; 6,0-6,8; однозамещкенчйый фосфорнокислый (46) 30.07.92. Бюл. М 28 .. . калий 3,0-3,8; глюкоза 5,0 — 7;0; дистиллирол (71) Украинский научно-исследовательский ванная вода до 1 л, оделяют токсиносодеринститут экспериментальной ветеринарии жащий супернатант",термолабильный и (72) Г.В. Гнвтенко vi l0;C, Сухарев тердмтостабильйый тоКсйньы осаждают суль(56) Патент США М 4411888,:. фатом аммония при" разной степени насыкл. А 61 К 39/108, 1983.::: щения, выдерживают преципитаты 18 — 20 ч прй 2-4 С, цейтрируют осадки термола(54). СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРО- бильного и термостабильного токсинов, ВАННОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ЕЯНЕЙ!СН1А растворяют в дистичлличрованнокй воде и

COLl — " ; .;: . :.; .. : .: - трис-HCI буфере соответственно и диализу(57) Изобретение относится к бйоттехнолот-" - ют, после чего:ихк оолбьедийяют в Соотношегиииможетбытьисйользовано,циль получе- нии 100:1 и конъюгируют глутаровым ния конъюгированното термостабильного. альдегидом "до- конечной концентрации 2 знтеротоксина кишечйой палочки, Сущ- г/л, конъюгат диализуют сначала против ность изобретения: культивированйе токси- - фосфатного буфера, а затем против трисгенных штаммов осуществляют на среде HCI буфера, конъюгат растворяют в трисследующегосостава,г/л:переварХоттинге- НО буфере, содержащем бычий сыворора 80-250; сернокислый магний 3,0-3,8: од- точный альбумин. 6 табл.

Vl

Изобретение относится к биотехйолои- Наиболее близким техйическим решени- С гии и касается способа получения конъюги- " ем является способ получения коньюгирован- О » рованного термостабильного энтероток- ного энтеротоксина из термостабильного и 43 сина кишечной палочки и может быть ис- термолабильного энтеротоксинов Е.coll с по- С1 пользовкалнто"в птроизводстве вакьцинных пре- мощью1 этил 3/3диметиламикйопропил/ карпаратоа против колибактериоаа и бодиииида. Предварительно очищенный 1чь смешанной инфекции (колибактериоз, рота, - термостабильный и термолабильный энтерокоронавйрусная ийфекция). токсины с помощью хроматографии (амберКишечная палочка, которая выделяется лйт НАД-2), ацетонного фракционирования, . от больных и павших телят, в основном про- последовательной гельфильтрации на сефадуцирует термостабильный энтеротоксин и дексе G25, конъюгировали в 0,1 М фосфатном в малой степенй термолабильный. Термо- буфере(рН 7,0) в течение 96 часов при 4 С, с стабильный энтеротоксин не обладает им- последующим диализом против Н20 в течемуногеннйми свойствами. Он приобретает ние 48 ч при 4 С, зти свойства лишь в сочетании с носителем Однако известный способ имеет слес большей молекулярной массой. - дующие недостатки: термостабильный и тер1750690 молабильный энтеротоксины подвергали длительной очистке с использованием дорогостоящего оборудования и реактивов: хроматографии (амберлит НАД-2), ацетонного фракционирования последовательной гельфильтрации на сефадексе G25 и ионнообменной хроматографии (ДАЕ сефацил), повторной хроматографии на сефадексе

025; Вследствие больших потерь токсинов на этапах очистки, особенно на этапах ионнообменной и тонкослойной хроматографии не удается собрать достаточного количества токсинов, необходимых для проведения всего комплекса исследований по канъюгированию и для иммунизации больших групп животных. Коньюгацию энтеротоксинов осуществляют с использованием дорогостоящего реактива 1 атил 3/3 диметиламинопропил/ карбодиимида, который в нашей стране не производится, Метод требует строгого соблюдения оптимального соотношения карбодиимида и энтеротоксинов при конъюгации. Так при повышении этого соотношения до 100:1 резко снижается антигенность конъюгата. Увеличение времени коныогации существенно не влия-. ет на увеличение процента содержания термостабильного энтеротоксина в конечном конъюгате. При сокращении времени коньюгации менее 18 ч резко снижается антигенность конъюгата. На весь процесс кбнъюгации энтератоксинов затрачивается более 260 ч.

Цель изобретенйя — повышение иммуногенности целевого продукта, ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование штаммов E.coÈ, продуцирующих термостабильный и термолабильный знтеротоксины, осуществляется на . среде, содержащей; перевар Хоттингера

80 — 250 мл (1000 мг% аминного азота), магний сернокислый 3,0 — 3,8 г, натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,0-6,8, калий фосфорнокислый однозамещенный 3.0-3,8, глюкоза 5,0 — 7,0 (только для термостабильного энтеротоксина), вода дистиллированная до 1 л.

18 — 24-часовые культуры центрифугирулот при 6000-8000 об/мин, в течение 30-40 мин, удаляют биомассу, токсиносодержащий материал осаждают сульфатом аммония из расчета 650 г/л, Осажденный токсиносодержащий материал центрифугируют при 6000-8000 об/мин, в течение 3040 мин на холоду, надосадок удаляют, а суммарные белковыэ фракции.энтеротоксинав обрабатывают смесью этанол-эфир (1;1) для удаления липидов, Центрифугируют при 6000-8000 об/мин в течение 10-20

5 Обессоливание и фракционирование суммарной белковой фракции термостабильного энтеротоксина проводят на хрома10

20

40 вавший термостабильный энтеротоксин и, глута рак. ьдегид, 50 Количество связанного термостабиль30

35 мин при 2-4 С. Верхний слой отбрасывали, а осадок перерастворяли в 0,05 M трис-HCI буфере из расчета 1/10 от начального объема, тографических колонках с сефадексом G-25, а термолабильного — G-150, Элюцию проводили 0,15 í NaCI. В ходе фракционирования выделяют 5 белковых фракций термостабильного и термолабильнаго энтеротоксинов, Концентрацию белка в выделенных фракциях определяют с помощью спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Для электрофоретического контроля гомогенности выделенных фракций их разводят в 50 мкл фосфатна-солевого буфера, содержащего 5% ДСН, Биологическую активность фракций термостабильного энтеротоксина определяют с помощью теста анальной пробы на мышатах-сосунах, а термолабильного — с помощью теста отека лап белых мышей и Бикентеста

Белковые фракции термостабильного и термолабильного энтератоксинов, обладающие наибольшей биологической активностью, концентрируют против ПЭГ и используют для конъюгации.

Готовят смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в соотношении. 100;1 в фосфатно-солевом буфере (рН

7,0 — 7,2). К смеси добавляют 25%-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 1-3 г/л, полученную смесь выдерживают 1-2 ч при 18-20 С, и получают конъюгат. Коньюгатдиализируют против фасфатно-солевого буфера (рН 7,0-7,2) в течение

20 — 24 ч при 2 — 4 С. Проводят повторный диализ против 0,05 M трис-HCI буфера (рН

8,0 — 8,2) в течение 20 — 24 ч при 2 — 40С, С помощью диализных мешочков происходит задержка всего конъюгированного энтеротоксина и выделяется непрареагиронаго энтеротоксина в конъюгате определяют посредством суммирования возрастания количества белка (по Лаури), присутствующего в диализате сверх количества термолабильного токсина, первоначально добавленного в конъюгат. Для увеличения иммуногенной активности полученного конъюгата к нему добавляют раствор трис-HCI буфера, содержащий бычий сывороточный альбумин из расчета 10 г/л, рН 8,0-8,2.

1750690

Полученный конъюгат при необходимости концентрируют до 1/10 объема против

ПЭГ, Термостабильный и термолабильный энтеротоксины концентрируют и очищают с помощью более мягкого способа сульфатом аммония, в отличие от более грубого ацетонного фракционирования в прототипе, что зачастую приводит к значительным потерям

) активности токсиносодержащего материа- 10 ла, вследствие денатурации белковых молекул.

Для конъюгации термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в предлагаемом способе используют глутаральде- 15 гид, который является не только хорошим сдваивающим агентом, но и веществом, значительно снижающим токсические свойства конъюгата, при полном сохранении антигенных детерминант его составляющих.

Использование глутаральдегида для конъюгации энтеротоксинов Е,coll позволяет сократить время конъюгации почти в.30 раз, по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ позволяет получать конь огированный знтеротоксин Е.coll в количествах, достаточных для иммунизации больших групп животных, а также добиться увеличения на 10-20% выхода конечного продукта.

Добавление к новому молекулярному образованию, конъюгированному эитеротоксину Е,coll, бычьего сывороточного альбумина позволяет значительно увеличить его иммуногенную активность, Использование в заявляемом решении легкодоступных реактивов и -оборудования позволяет ускорить способ получения коньюгированного энтеротоксина Е.coll более чем в 2 раза.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Культуры кишечной палочки, выделенные от павших животных, продуцирующие термостабильный и термолабильный энтеротоксины, высевают раздельно на питательную среду, содержа-. щую следующие компоненты; перевар Хоттингера 200 мл (содержание аминного азота

1000 мг ); калий фосфорнокислый однозамещенный 3,5 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,5; сульфат магния 3,5; глюкоза 6,0 (только для культивирования термолабильного штамма Е.coll), вода дистиллированная до 1 л, рН 7,14 и культивируют в течение 20 ч при 37 С в условиях аэрации. Бульонные культуры центрифугируют при 8000 об/мин при 4 С в течение 40 мин и получают надосадочную жидкость, содержащую энтеротоксины, 20

Токсиносодержащий материал осаждают медленным добавлением сульфата аммония из расчета 650 г/л и оставляют на 20 ч при непрерывном встряхивании при 4 С, Через 2 ч токсиносодержащий материал осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин на холоду. Осадки суммарных белковых фракций знтеротоксинов обрабатывают смесью этанол-эфир (1:1) с целью удаления липидов. Центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин, верхнюю эфи рсоде ржащую фазу удаляют, а осадок перерастворяют в 0;05 M трис-HCI буфере (рН 8,0) из расчета 1/10 от начального объема.

Материал, содержащий термостабильный энтеротоксин, обессоливают и фракционируют на хроматографической колонке с сефадексом G-25, а термолабильный энтеротоксин — на колонке с сефадексом G-150.

Элюцию проводят 0,15 í NaCI (рН 7,0), скорость удаления жидкости из колонки 2-3 капли в минуту. Элюат собирают фракциями по 5 мл, Количество белка в каждой фракции определяют на спектрофотометре СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и

Христиана, Для электрофоретического контроля гомогенности выделенных фракций их разводят в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5;(, ДСН.

Биологическую активность выделенных фракций термостабильного энтеротоксина определяют с помощью теста анальной пробы на мышатах-сосунах, а термолабильного — с помощью отека лап белых мышей и Биккентеста.

Белковые фракции, обладающие наибольшей биологической активностью, концентрируют против ПЭГ до 1/10 объема и используют для конъюгации.

Готовят смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в фосфатносолевом буфере рН 7,0 в соотношении

100:1. К смеси добавляют 25 (,-ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 2 г/л, полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 20 С и получают

KpHbiocBT. Конъюгат диализируют против фосфатно-солевого буфера рН 7,0 в течение

20 ч при 4 С. Проводят повторный диализ против 0,05 М трис-HCI буфера рН 8,0 в течение 20 ч при 4 С.

Количество связанного термостабильного энтеротоксина в конъюгате определяют посредством суммирования возрастания количества белка (по Лаури), присутствующего в диализате сверх количества термолабильного энтеротоксина, первоначально добавленного в конъюгат. Для увеличения

1 150690

30

7 иммуногенной активности полученного конъюгата к нему добавляют раствор трисНС! буфера, содержащего бычий сывороточный альбумин из расчета 10 г/л, рН 8,0.

Полученный конъюгат при необходимости концентрируют до 1/10 объема против

ПЭГ;

Контроль стерильности и безвредности полученного препарата осуществляют по общепринятой методике.

Иммуногенность препарата вместе с адъювантом (раствор гидроокиси алюминия) проверяют на белых мышах массой 16

r. Вакцинирующий материал вводят двукратно, подкожно в дозе 0,3 и 0,5 мл с интервалом в 7 дней, Через 20 дней после второй прививки животных заражают летальными дозами термостабильного и термолабильного энтеротоксинов и культурами гомологических и гетерологических штаммов Е.coll. . Вакцинированные животные в 95% случаев проявляют устойчивость против 2 ДЛМ токсинов и ЛД50 культур гомОлОГичйого и в

80% случаев защита оставила против 2 ДЛМ токсинов и ЛДьо культур гетерологичных штаммов Е,coll, В KQHTpoëüíûõ группах мыши, которых заражают 2 ДЛМ токсинов и ЛДьо культур, палй в 90% случаев.

Сенсибилизирующую активность препарата исследуют в тес ге активной систем ной анафилаксии на морских свинках по методу Немова.

Пример 2. Культивирование токсигенных штаммов E.coll, получение нативных

: токсинов, их концентрирование и очистку, контроль гомогенности и определение биологической активности проводят аналогично примеру 1, Готовят смесь термостабилъного и термолабильного энтеротоксинов в фосфатносолевом буфере в соотношении 50:1 (рН 7,0).

К смеси добавляют 25%-ный раствор глугаровогЬ альдегида до конечной концентрации 2 г/л, полученную смесь выдерживают при 20ОС в течение 2 ч, Полученный конъюгат диализируют против фосфатно-солевого :буфера (рН 7,0) в течение 20 ч при 4ОС.

Повторно диализируют йротив 0,05 М трис-

НО буфера (рН 8-0) в течение 20 ч при 4ОС.

В конъюгат добавляют трис-HCI буфер, содержащий БСА.

Пример 3. Культивирование кишечной палочки продуцирующей термостабильный и термолабильный энтеротоксины, получение и очистку, ойределение гомогенности и биологической активности осуществляли как в примере 1, В данном примере готовят смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в соотношении

150:1 в фосфатно-солевом буфере рН 7,0.

Конъюгацию проводят аналогично примеру

1..

Пример 4. В примере 4 изменена концентрация глутарового альдегида с 2 г/л до 1,5 г/л. Смесь термостабильного и термолабильного энтеротоксинов готовят в соотношении 100:1 в фосфатно-солевом буфере рН 7,0. В дальнейшем конъюгацию проводят аналогично примерам 1-3;

Пример 5. В этом примере концентрация глутарового альдегида взята 2,5 г/л.

Термостабильный и термолабильный энте15 ротоксины берут в соотношении 100:1. Режим конъюгации тот же, что и в примере 1.

Данные, иллюстрирующие выше иэложенные примеры, приведены в табл. 1-6

Изменение соотношения компонентов питательной среды, времени культивирования бакмассы и изменение температуры культивирования оказывают существенное значение на содержание энтеротоксинов в культуральной жидкости.

П. р и м е р 6. Культуры кишечной палочки, выделенные от павших животных, продуцирующие. термостабильный и термолабильный энтеротоксины, высевают раздельно на питательную среду, содержащую следующие компоненты: перевар Хоттингера—

80 мл (содержание аминного азота 1000 мг%), калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,0 г сульфат магния 3,0 г; глюкоза 5,0 г; вода дистиллированная до

: литра, рН 7,14 и культивируют в течение 18 ч при 36 С в условиях аэрации. Бульонные культуры центрифугируют при 6000 об/мин при 2 С в течение 40 мин и получают над40 осадочную жидкость, содержащую энтероТОКСИНЫ.

Количество белка в надосадочной жидкости, содержащей энтеротоксины, составляет 9000 мкг/мл.

Пример 7, Культуры кишечной палочки высевают раздельно на питательную среду, содержащую следующие компоненты: перевар Хоттингера 250 мл (содержание

50 аминного азота 1000 мг%), калий фосфорнокислый Однозамещеннйй 3,8 г; натрий фосфорнокислый однозамещенный 6,8 г; магний сернокислый 3,8 r: глюкоза 7,0 г; вода дистиллированная — до литра, рН сре55 ды 7,14 и культивируют в течение 24 ч при

38 С, в условиях аэрации, Бульонные культуры центрифугируют при 6000 об/мин при

3ОС, в течение 40 мин и получают надосадочную жидкость. содержащую энтеротоксины, Количество белка в надосадочной жидкости, 1750690

10 содержащей энтеротоксины, составляет

7000 мкг/мл.

Максимальное содержание белка в надосадочной жидкостй (11000 мкг/мл) отмечается при оптимальном соотношении 5 компонентов питательной среды, времени и температуре культивирования, как в примере 1, а наименьшее содержание белка — при соотношении компонентов, как в примере 7.

Извинение режима центрифугирования 10 бульонных культур с 6000 до 8000 об/мин, позволяет добиться более полного осаждения бактериальных частиц. Увеличение скорости центрифугирования более 8000 . об/мин не оказывает существенного влия- 15 ния на полноту осаждения. Поэтому.оптимальным режимом центрифугирования выбрана скорость 8000 об/мин.

Пример 8. После центрифугирования и определения биоактивности термоста- 20 ным добавлением сульфата аммония до 25

35 ды в течение 48 ч

Формула изобретения

Способ получения конъюгированного энтеротоксина Escherichla coll, включающий культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде, отделение токсиносодержащего супернатанта центрифугированием с последующим осаждением, очисткой и конъюгацией энтеротоксина сшивающим агейтом, отличающийся . тем, что, с целью повышения иммуногенно.сти целевого продукта, ускорения и упрощения способа культивирование осуществляют в течение 18 — 24 ч в жидкой питательной среде следующего состава, г/л: перевар

Хоттингера 80 — 250; сернокислый магний

3,0 — 3,8; однозамещенный фосфорнокислый натрий 6,0 — 6,8; однозамещенный фосфорнокислый калий 3,0-3,8; глюкоза 5,0 — 7,0;

50 бильного и термолабильного энтеротоксинов, в надосадочной жидкости по методике

Романенковой Н.И. и в Биккен-тесте,"токсиносодержащий материал осаждают медлен65 насыщения для термолабильного и до

90 насыщения для термостабильного эн.теротоксинов и оставляют на 18 ч при 2 С.

Осадок, содержащий термостабильный энтеротоксин, перерастворяют в 0.05 М трисHCl буфере (pH 8,0), а термолабильный — в дистиллированной воде из расчета 1/10 от начального объема. Растворенные осадки диализируют против дистиллированной воПосле определения гомргенности полученных энтеротоксинов с помощью дискэлектрофореза в полиакриламидном геле готовя смесь термостабильного и термола- бильного энтеротокеинов в соотношении

100:1 в фосфатно-солевом буфере (pH 7,0). К смеси добавляют 25 -ный раствор глутарового альдегида до конечной концентрацйи 2 г/л, реакционную смесь выдерживают 1 ч при 25ОC. Конъюгационную.смесь подвергают диализу против фосфатно-солевого буфера (рН 7) s течение 18 ч при 4ОС.

Уменьшение времени высаливания с 20 до 18 ч приводит, в некоторых случаях, к недоосаждению части энтеротоксинов. Диэлиз перерастворенных осадков токсинов, в течение 48 ч позволяет добиться полного освобождения материала от сернокислого аммония. Полноту освобождения от следов сульфат-ионав контролируют в реакции с

10 -ным ВаСЬ.

Выдерживание реакционной смеси,.энтеротоксинов и глутарового альдегида, в течение 1 ч, достаточно для получения конъюгата, однако инкубация смеси в течение 2 ч позволяет добиться более полного соединения термостабильного и термолабильного энтеротоксинов.

Увеличение температуры при реакции конъюгации с 20 до 25 С существенно не влияет на скорость связывания термостабильного и термолабильного энтеротоксинов, однако. увеличение или уменьшение данного режима температур ведет к задержке конъюгации и требует увеличения времени реакции.

Конъюгат термостабильного и термолабильного энтеротоксинов представляет собой прозрачную жидкость бурого цвета (рН

8,0) без запаха, он не токсичен и безвреден для животных, не обладает анафилактогенными свойствами. Контроль стерильности и .безвредности полученного конъюгата осуществляют по общепринятой методике, Полученный конъюгат по своей биологической активйостй значительно превосходит прототип. Предлагаемый способ ускоряет получение препарата в 3 раза (вместо 260 ч, около 70). Он существенно сокращает рабочее время, занятое соответствующими операциями. Число процедур минимально, они лишены трудоемкости. Упрощена и ускорена процедура получения и очистки энтеротоксинов, а также самой конъюгации, Предлагаемый способ не нуждается в дорогостоящем .и мало доступном оборудовании и реактивах; амберлит НАД-2, сефа- декс 6-25, ДАЕ сефацил, 1 этил 3/3 диметиламинопропил/ карбодиимид и др. Привитые конъюгатом лабораторные животные проявляют высокую активность (957;) против летальных доз термолабильного и термостабильного энтеротоксинов и культур гомологичных и гетерологических штаммов кишечной палочки.

1750690

12 дистиллированная вода до 1 л, токсиносодержащий супернатант делят на две части, иэ одной осаждают термолабильный токсин раствором сульфата аммония при 60 — 65% насыщения, из другой — термостабильный токсин при 85 — 90% насыщения, каждый иэ полученных преципитатов выдерживают

18 — 20 ч при 2 — 4 С в режиме встряхивания, центрифугируют при 6000 — 8000 об/мин в течение 30 — 40 мин при 2-4 С, далее-осадок термостабил ьного токсина растворяют в дистиллированной воде, а осадок термолабильного токсина — a 0,05 М трис-НС! буфере иэ расчета 1/10 от начального объема; очистку токсинов проводят диалиэом, затем их объединяют в объемном соотношении 100:1 соответственно в фисфатном буфере рН 7,0-7,2, конъюгацию проводят

5 25%-ным раствором глутарового альдегида при конечной концентрации 2 г/л при 20—

25 С в течение 1 — 2 ч, далее конъюгат двукратно диалиэуют против фосфатного буфера рН 7,0-7,2 в течение 18-20 ч при

10 2-4 С, а затем против 0.05 М трис-HCl буфера в течение 18-20 ч при 2-4 С, в полученный конъюгат добавляют раствор трис-HCI буфера, содержащий бычий сывороточный альбумин в концентрации 10 г/л.

Таблица 1

Влияние соотношейия термостабильный/термолабильный знтеротоксины íà % содержаний термостабильного знтеротоксина в конечном конъюгате.

Молярное соотношение термостабильный/ термолабильный знтеротоксины

Концентрация белка до конъюгаии, мкг/мл

Содержание термостабильного токсина в конечном конъюгате, Концентрация белка после конъюгации, мкг/мл термостабильно- термолабильного го токсина токсина

7500

7202,5

7668,7

7950,0

8906,2

10875,0

14850,0

1:1

5:1

10 . 1

25: 1

50: 1

100: 1

7500

Таблица 2

Влияние соотношения глутаральдегид/общий белок на % термостабильного знтеротоксина в конечном конъюгате

Термостабильный токсин в конечном конъюгате, . Соотношение глутарал ьде гид/ общий белок

Концентрация белка перед конъюгацией мкг/мл

Молярное соотношение термостабильный/ термолабильный токсины

Концентрация белка в конечном конъюгате, мкг/мл

0,1: 1

0,25: 1

0,50: 1

1:1

1,5: 1

2:1

2,5: 1

3:1

100: 1

100: 1

100: 1

100: 1

100: 1

100: 1

100: 1

100: 1

7070

77,0

420,0

1127;0

1995,0

2695,0

2877,0

2877,0

3045 0

0,1

5,0

15,1

27,5

37,5

40,1

40.1

42,1

1750690

13

Таблица 3

Иммуногенная активность конъюгированного знтеро- токсина Е.coll в сравнении с энтеротоксинами гомологичных штаммов Е.coll и прототипом

Сравнение токсинообраэования на предлагаемой среде и известных в литературе средах: Финкельштейна, бульоне Хоттингера и среде Альдерете

Таблица 5

Влияние режимов центрифугирования на полноту осаждения бактериальных клеток

Таблица 6

Влияние времени конъюгации на термостабильного знтеротоксина Е,соИ в конечном конъюгате

1150690

Продолжение табл.6.

Составитель Г.Гнатенко

Редактор М.Товтин Техр!ед М.Моргентал, Корректор В.Гирняк

Заказ 2639 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета rio.èçîáðåòåíèÿì и открытйям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

160: 1

100: 1

100: 1 л Л

7373

7373

7373

2:1

2:1

2:1

1,5

2,0

2,5

2,883,.5

2920,0

2920,0

39,5

40,0

40,0