Питательная среда для получения антигена адгезии 987 @ р энтеропатогенных еsснеriснiа coli

 

Использование: ветеринарная микробиология , антиген адгезии, выявление антигена , питательная среда, состав, диагностика колибактериоза. Сущность изобретения заключается в том, что для выращивания штамма, исследуемого на наличие антигена адгезии 987Р, используют питательную среду , содержащую помимо мясо-пептонного агара 0.1-0,25 бикарбонат натрия, 0,05-0,1 г инозита, 0,05-0,1 г хлористого калия. 2 табл, 2 2 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР ЬщУд:ф ЫВФФ. Щ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21} 4805676/13 (22) 26,12.89 (46) 15,07,92. Бюл. N 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) E.B;Çèí÷eHêo и E.È.Попов (53) 576.8.093 (088,8) (56) Заявка ¹ 86/04604, РСТ, кл. С 12 N

1/20, А 987Р fimbriae -producing

microorganism, s à vaccine for the

immunization of РОЯ, as well as à method for

production of the Уасс!пе. Slagterienes

Forsknigsinstitut (OK) — 418/85, заявлено

3.1.01.85, опублик. 14.08.86.

Richard Е. Jsaakson, Patricia Richter.

Escherichia coli 987P, Pilus: purification and

partial characterization Journal of

"Bacteriology, 1981, 146, 784-789. .Jesper К. Pedersen, Per Klemm and ИИт

Jaastra. 987P. fimbriae from рогс1пе

entегоxigenie Escherichia coli, characterization, n-terminal amino acid seguence

and immunization with purification antigen, Ferns Microbiology Zeniens, 1986, 33, 229234, Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для выявления антигена адгезии 987Р при диагностике колибактериозов молодняка сельскохозяйственных животных.

Диареи, вызываемые энтеропатогенными штаммами Escherichia coli, играют ведущую роль в заболеваемости молодняка сельскохозяйственных животных, Установлено, что наличие антигенов адгезии на поверхности бактериальной клетки

„, Я „„1747481 А1 (я)5 С 12 N 1/20, А 61 К 39/108

2 (54} ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА АДГЕЗИИ 987Р ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ESCHERICHIA COLL (57) Использование; ветеринарная микробиология, антиген адгезии, выявление антигена, питательная среда, состав, диагностика колибактериоза, Сущность изобретения заключается в том, что для выращивания штамма, исследуемого на наличие антигена адгезии 987Р, используют питательную среду. содержащую. помимо мясо-пептонного агара 0,1-0,25 бикарбонат натрия, 0,05-0,1 r инозита, 0,05-0,1 r хлористого калия, 2 табл. коррелирует с вирулентностью штамма.

Так, гибель животных от диареи, вызываемой штаммами, синтезирующими антиген адгезии 987Р, может достигать 100%. Меры борьбы с заболеванием включают в себя тестирование возбудителя, профилактическое вакцинирование и лечебные мероприятия. В двух первых случаях необходимо выделение антигена 987Р, Однако выражение этого признака подвержено так называемой фазовой вариации, Синтез пилей происходит по принципу "все или ничего".

3, 1747481

Выращивание возбудителя в лабораторных условиях селективно для беспилевой фазы.

Известно получение Flm колоний для выделения антигена адгезии путем комбинации жидких и твердых сред различного состава. Пробирки с 10 мл BHI (Difco) засевают синтезирующим фимбрии 987Р штаммом в беспилевой фазе, культивируют в статических условиях 18 ч при 37 С и делают высев из верхней части пробирки на .твердую питательную среду на основе BHI до изолированных колоний, Крупные прозрачные колонии, выросшие через 18 ч при

37"С вновь высевают в пробирки с жидкой средой и повторяют описанную процедуру

2-3 раза, Через 3 пассажа удается оттестировать несколько колоний, синтезирующих антиген адгезии 987Р. Стабильность синтеза в работе не указана.

Недостатком сочетания жидкой и твердой питательных сред на основе BHI является длительность эксперимента (до 30 сут) и небольшое количество Fim колоний.

Известно получение Fim колоний штаммов, синтезирующих адгезин 987Р на триптическом соевом агэре (TSA, Difco) с добавлением 1% а-метилманноэида в атмосфере 5% СОг, 1

Недостатком этой среды является низкая частота появления Flm колоний и быстрая утрата признака при пересевах.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является мясо-пептонный агар с добавлением 5% крови барана.

Недостатком этой среды является либо отсутствие экспресии антигена, либо быстрая утрата признака, если он есть, при пересевах.

Цель изобретения — стабилизация накопления целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что для выращивания штамма, исследуемого на наличие адгезина, применяют мясо-пептонный агар, дополнительно содержащий бикарбонат натрия, иноэит и хлористый калий при следующем содержании компонентов, г;

КагСОз 0,1-0,25

Инозит 0,05-0,1

KCI 0,05-0,1

Мясо-пептонный агар До 100

Пример 1. Для приготовления среды, содержащей 0,1 г Ка СОз, 0,05 г инозита и

0,05 г KCI, стерильно смешивают 1 мл 10%ного раствора NazCOs, 0,5 мл 10%-ного раствора инозита и 0,5 мл 10%-ного раствора

KCI. Затем объем среды доводят до 100 мл расплавлением мясо-пептонным агаром, перемешивают и разливают в чашки Петри по 20 мл. На приготовленную таким обра55 трации Ка СОз и инозита более чем в два раза приводит к подавлению роста исследуемого штамма. Уменьшение их концентраций — к репрессии синтеза антигена 987Р и стабильности его выражения при пересевах.

50 зом среду засевают референс — штамм

Escherichia coli 987 (NADC из лаборатории

Национального центра болезней животных

США, Харгет B,Мун) до изолированных колоний и выращивают 18 ч при 37 С. 50 произвольно выбранных колоний перекалывают на испытуемую среду, выращивают в тех же условиях и проверяют на наличие адгезина в реакции агглютинации на стекле со специфической анти-987Р-сывороткой. Таким образом проведено 10 пассажей. Результаты свидетельствуют о том, что 100% исследуемых колоний сохраняют максимальное выражение признака в течение 10 пересевав.

Пример 2. Для приготовления среды, содержащей 0„25 г Ка СОз, 0,1 г иноэита и

0,1 r KCI, стерильно смешивают 2,5 мл 10%ного раствора КагСОз 1 мл 10%-ного раствора инозита и 1 мл 10%-ного раствора KCI.

Затем обьем среды доводят расплавленным мясо-пептонным агаром до 100 мл, перемешивают и разливают по 20 мл на чашки

Петри. Анализ пилеобраэовэния выполняется аналогично примеру 1. Результаты тестировэния пятидесяти колоний анти-987Р-сывороткой показывают, что, используя среду предлагаемого состава, можно добиться 100% экспрессии признака на протяжении 10 пересевов.

Пример 3..Для приготовления среды, содержащей 0,175 r Ка СОз, 0,075 г иноэита и 0,075 г КС1, стерильно смешивают 1,75 мл

10%-ного раствора Ка СОз, 0,75 мл 10%-ного раствора иноэита и 0,75 мл 13%-ного раствора KCI, Затем объем среды доводят до

100 мл расплавленным мясо-пептонным агаром, перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают, На приготовленную таким образом среду засевают референс штамм Escherichia соИ 987до изолированных колоний и выращивают 18 ч при 37 С. Дальнейшие исследования проводят как описано в примерах 1 и 2. Полученные результаты соответствуют данным, представленным в примерах 1 и 2. Суммирование результатов, приведенных в примерах 1 и 2, а также изложенный свидетельствуют о том, что входящие в состав, предлагаемой среды инградиенты в интервалах 0,1-0,25 г (сода), 0,05-0,1 г (инози г), 0,05-0,1 r (калий хлористый) не влияют на рост бактериальных клеток, на выражение антигена 987Р, Увеличение в среде концен1747481

Отсутствие KCf, в питательной среде, также как и присутствие его в более высоких концентрациях (0,2 г), чем указано в предлагаемой среде, не влияет на рост бактериальных клеток, однако его присутствие необходимо для полноценного и стзбильного синтеза антигена 987Р.

Пример 4. Выращивание референсштамма на мясо-пептонном агаре, Мясопептонный агар разливают по 20 мл в чашки

Петри, подсушивают и перекалывают на них

50 колоний штамма, находящегося в фазе пилеобразования (с предлагаемой среды).

Затем выращивают колонии 18 ч при 37 С, тестируют анти-987Р-сывороткой и вновь перекалывают на мясо-пептонный агар.

Сделано 7 пересевов, результаты свидетельствуют о том, что синтез антигена при пересеве.штамма, находящегося в фазе пилеобразования, на мясо-пептонном агаре подвержен значительным колебаниям. Через 7 пересевав только 10 j< <колоний синтезируют адгезин.

Пример 5. Анализ пилеобразования на мясо-пептонном агаре, содержащем только NazCOg. Для приготовления среды, содержащей 0,1-0,25 г КагСОз, стерильно смешивают 1-2„5 мл 10, -ного раствора

Иа СОз и мясо-пептонный агар до конечного обьема 100 мл. Дальнейший анализ проводят соответственно примеру 1. Данные анализа синтеза антигена пятьюдесятью произвольно выбранными колониями референс-штамма показывают, что при использовании для выращивания штамма среды, содержащей 0,1-0,25 r йа2СОз,синтез антигена подвержен значител ьн ы м -колебаниям (штамм взят в стадии пилеобразования).

Пример 6. Для приготовления среды, содержащей 0,1 г Ма2СОз и 0,05 г инозита, стерильно смешивают 1 мл 10 -ного раствора йа СОз, 0,5 мл 107;-ного раствора инозита и добавляют расплавленный мясопептонный агар до конечного объема 100 мл, Дальнейший анализ проводят в соответствии с примером 1, Данные анализа синтеза антигена штаммом, находящимся в фазе пилеобразования, показывают, что добавление двух указанных компонентов в мясо-пептонный агар недостаточно для максимального стабильного выражения признака.

Бикарбонат натрия

Инозит

Хлористый калий

Мясо-пептонный агар

0,1-0,25

0,05-0,1

0,05-0, 1

До 100

Пример . Сравнительные характеристики питательных сред для выявления адгезии 987Р. Триптический соевый агар (TSA, Difco), агар на сердечно-мозговой вы5 тяжке (HHi, Difco), среда Дагестанского

НИИ на основе гидролизата кильки готовятся в соответствии с прописями. Для приготовления кровяной среды 95 мл расплавленного мясо-пептонного агара сте10 рильно смешивают с 5 мл дважды отмытых зритроцитов барана. Предлагаемая среда готовится как указано в примере 1. Все среды разливают на чашки по 20 мл,. высевают на них штрихом референс-штамм Е,coli 987.

15 находящийся в беспилевой фазе, и выращивают в течение 18 ч при 37 С. Затем проверяют на наличие антигена и вновь пересевают на ту же среду .

В табл,1 представлены результаты 6 пе20 ресевов референс-штамма на различных, средах.

Из табл.1 следует, что предлагаемая среда способствует максимальному стабильному выражению антигена у штамма, 25 находящегося в беспилевой фазе.

Пример 8. Среды готовятся как указано в примере 7. Анализ признака производится так же. С целью изучения стабильности выражения признака

30 референс-штамм засевают в пилевой фазе.

Результаты представлены в табл.2.

На среде предлагаемого состава пилевая фаза сохраняется стабильно, Таким образом, из приведенных приме35 ров следует, что среда предлагаемого состава стимулирует выражение антигена адгезии 987Р, а также способствует поддержанию его максимального количества.

Формула изобретения

40 Питательная среда для получения антигена адгезии 987Р знтеропатогенных

Escherichia coii, включающая мясо-пептонный агар, отличающаяся тем, что, с целью стабилизации накопления целевого

45 продукта, она дополнительно содержит бикарбонат натрия, инозит и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, г:

1747481

Таблица 1

Таблица 2

Составитель Е.Попов

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М.Демчик

Редактор Е.Копча

Производственно-издательский комбинат Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2473 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5