Рекомбинантная плазмидная днк рек 8, кодирующая фибринолизин yersinia реsтis, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент фибринолизина yersinia реsтis

 

Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Получена рекомбинантная плазмидная ДНК рЁК8, кодирующая фибринолиэин Yerslnla pestls, полученной плазмидой трансформируют штамм Escherlchla coll K80pEK8Ac1857 S7:Cm KM 9 (6,2 т.п.н.) с последующим отбором штамма Е. coll КМ-9 - продуцента фибриноли,зина Y. pestis. 3 с.п. ф-лы. С , e

СОЮЗ СОЦЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (зцю С 12 и 15/12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I (21) 4834179/13 (22) 04.06.90 (46) 30.07.92. Бюл. N 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) Е, Г. Булгакова и Ю, А. Попов (53) 575.224,2:577.2(088,8) (56) "Биотехнология", 1989, т. 5, Ь 1, с. 9-14.

F. of General lVllcrobiol., 1989, v. 135, р. 2365-2378.

infection and Immunliy, 1989, v, 57, Ь 8, р. 1731-1739.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинайтную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез фибринолизина чумного микроба, способ конструирования рекомбинантной ДНК .и штамм бактерий кишечной палочки — продуцент фибринолизина.

Подавляющее большинство штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах СССР и за рубежом, обладает фибрйнолитической активностью. П редполагаемая видоспецифическая природа белка, обеспечивающего зто свойств, открывает возможность разработки новых лабораторных диагностических препаратов с использованием очищенного фибринолизина чумного микроба.

Целью изобретения является конструи рование рекомбинантной ДНК, кодирующей синтез фибрийолизина Y. резт1в и получение штамма-продуцента фибринолизина. г

2 (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

:ДНК рЕК8, КОДИРУЮЩАЯ ФИБРИНОЛИЗИН УЕВЗМА PES Га СпОСО5 ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ECSl-iEniCHiA Co Li - nPOpvuEHT ei45РИНОЛИЗИНА УЕЙЗМА PESTIS (57) Использование: биотехнология, генети-. ческая инженерия. Получена рекомбинантная плазмидная ДНК рЕК8, кодирующая фибринолизин Yerslnia pestls, полученной плазмидой трансформируют штамм

Escherlchia соП К80рЕК 8Л с1857 37:Са-КМ

9 (6,: т.п.н.) с последующим отбором штамма Е. coti КМ-9- продуцента фибринолизина

Y. pestis. 3 с.п. ф-лы.

Ф

Рекомбинантную плазмидную ДНК

pEk8 конструируют следующим образом.

Ф рагмент плазмиды йестициногенности чумного микроба рРз размером 1,45 т.п.н, (Hind 111-Sma1), детерминирующий фибринолизин, встраивают в векторную

ДНК рВВ322 по сайтам рестрикции Hirid

111-EcoRV (полученная плазмида обозначена рЕК4). Из плазмиды рЕК4 вырезают фрагмент EcoR1-Pst1 (4,9 т.п.н,), включающий ген фибринолизина, а из векторной ДНК

pLC24 — Есой1-Pst1 (1,3 т.п.н.) фрагмент, содержащий Р промотор, Фрагменты лигируют и ДНК полученной гибридной плазмиды (рЕК8) трансформируют клетки Е. соИК802, В состав плазмиды рЕК8 входят гены: ген bla, обеспечивающий синтез/3-лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген fib, обеспечивающий синтез фибринолизина.

Плазмида содержит по одному участку расщепления зндонуклеазами Крп1, Bg)11, EcoR1, Pst1, Hind111, 2 участка расщепления эндонуклеазой BamH1.

1751206.Штамм продуцент фибринолизина получают трэнсфекцией клеток E,coll К802 фагом А C1857S7:Cm и последующей трансформацией лиэогенных клеток рекомбинэнтной плазмидной pEK8. 5 Штамм Escherlchla coll К802рЕК8

А c1857Sz, Cm характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грэмотри- 10 цательные, неспороносные.

Культуральные признаки. клетки kt>рошо растут на обычно используемых питательных средах, На 1,5 j питательном агэре

"Дифко" колонии серовато-белые, блестя- 15 щие, круглые. При выращивании нэ жидких

YT, LB средах образует ровную муть.

Физйолого-биохимические прйзнэки; оптимальная температура культивирования 28 С, оптимум рН 6,8-7,5. Увеличе- 20 ние.синтеза фибринолизинэ проиСходит йри повь1шении температуры культивирования до 42-44 С с последующей инкубацией при 37 С.

В качестве источника углерода исполь- 25 зуют многие углеводы, органические кислоты, спирты. .Источником азота могут служить минеральные соли (в аммонийной lttlM нитратной формы), органические соединения (в ниде 30 пептона, триатлона, аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам; проявля ют ус гойчивость к ампициллину (50-100 мкг/мл), хлорамфениколу (50-100 мкг/мл), Пример 1. А, Выделение ДНК плээ- 35 мйды pPst из штамма Y. pestls PKR133(pPst) и ДНК вектора pBR322 из штамма Е. collDH

1 (pBR522);

Клетки бактерий Y. pestls PKR133 (pl st) выращивают о 250 мл бульона LB с эзра- 40 цией в теченйе ночи. Клетки бактерий Е. coll

ЬН1 (pBR322) выращивают 2,5 ч в 250 мл бульона LB и проводят амплификацию плаэмидной ДНК добавлением хлорамфеникола (Ск "20 мкг/мл) в середине экспойенциэль- 45 ной фазы роста. ДНК плаэмид pPst u рВЙЗ22 выДеляют методом Blrnbolm Н„

cooly J„1979. Клетки бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин 4 С 15 мин). Осадок ресуспендируют о 10 мл рэс- 50 твора 1(50 мМ глюкоза, 25 мМ трис HCI p14

8,0 10 мМ ЗДТА) добавляют лизоцим до

Ск" 5 мг/мл и инкубируют 5-10 минут при комнатной температуре, Добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора II (0,2 h 55

NaOH, 1, SDS), перемешивают содер>кимое и инкубируют 1С-15 мин при комнатной температуре. Добавляют 15 мл раствора III (охлажденный 5 М ацетат натрия, рН 4,8), перемешивают содержимое и инкубируют оо льду 30 мин. Лизат осветляют центрифугированием при 4 С 20 мин при

2000 об/мин. К нэдосадочной жидкости добэоляют 0,6 объема изопропанола и инкубируют 1-2 ч при 15 С. ДНК оса>кдают центрифугированием при 12000 об/мин о течение 30 мин, при комнатной температуре, Осадок подсушивают, растворяют в буфере ТЕ, рН 8,0. Дальнейшую очистку Д1-IK проводят по известной методике равновесным центрифугированием о градиенте хлористого цезия с бромистым этидием, Концентрацию ДНК плазмид определяют спектрофотометрически.

Б. Конструирование гибридной плазмиды рЕК4.

ДНК плазмиды pPst(10 мкг) инкубируют с зндонуклеазэми рестрикции Hlnd111(8 ед) и Sma1 (8 ед) в буфере (20 мМ KCI, 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ NgCIz, 1 мМ дитиотрейтола) при 37 С 1 ч, Реакцию останавливают добавлением 0,5 M ЭДТА, pff 7,5 до конечной коицентрэции 10 мМ, Продукты гидролизэ разделяют с помощью электрофорезэ о 0,8Я, агэроэном геле. С помощью длинноволнового ультрафиолетового света оизуэлизируют положение меньшего (1,45 т,п,н,) иэ трех фрагментоо и электроэлюиро- . ванием в ванночку извлекают его иэ геля.

Элюат зкстрэгируют равным объемом фенола однократно, Водную фазу, отобранную после центрифугирооэния, при 20 С экстрагируют однократно равным обьемом хлороформа, После центрифугирования при 20 C отбирают водную фазу. ДНК плаэмиды

pl3R322 (10 мкг) подвергают гидролиэу рестриктаэами Hlnd111, ЕсоЯЧ по указанной методике (используют среднвсоИъой буфер. 50 мМ NaCI, 10 мМ (pH 7,4 трис-НСI, 10 мМ MgS04, 1 мМ дитиотрейтол) Больший (4,2 т,п.н,) из двух полученных фрагментбв извлекают иэ геля электроэлюцией. Элюат экстрэгируют равным объемом фенола однократно. Водную фээу, отобранную после центрифугирооания, яри 20 С экстрэгируют однократно равным абъемоМ хлорбформа, После центрифугировэния при 20 С отбирают водную фазу. Очищенный элюэт смешивают с элиотом, содержэщем

Iind111-Ягпа1 фрагмент ДНК pPst. ДНК осаждают 96 этэнолом, промывают 70 / зтанолом и подсушивают, Осадок растворяют о буфере для лигирования (0,066 М трис-НС1, рН 7,5; 5 мМ МцС1р, 5 мМ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ) с добавлением ДНК лигэзы фага Т-4 (5 ед). Лигировэние проводят 10-12 ч при 16 С.

1751206

В, Лналиэ рекомбинантных плазмид и форм (ЗДТА) лиэоцим, Обломки клеток выделение клона, несущего рекомбинан.г- осаждают. Супернатант, содержащий фагоную плазмиду рЕК4, вые частицы, используют для заражения.

Полученную смесь ДНК используют для Культуру Е, coll К802 (1 ° 10 кл/мл) сметрвнсформации клеток Е. соП К802. Транс- 5 шивают с 0,1 мл фаголизата и инкубируют 1 формировайные клетки подраи1ивают1 час ч при 28 С, полученную смесь разводят в бульоне LB и высевают на агаризирован- бульоном LH в 10 раз и 0,1 мл высевают на ную среду1В с ампициллином (20 мкг/мл). агар с хлорамфениколом (25 мкг/мл), инкуКлоны, вь1РОСшиЕ на среде с ампИЦИлЛИНОм, бируют при 28 48 ч. Выросшие клоны истестируют" на среде с тетрациклином (20 10 пользуют для трансформации гибридных мкг/мл) и плотной среде с фибрином, лизи- плазмид с Р промотором. руют"иайализируютметодомзлектрофоре- - Б,ПолучениештаммаЕ.coll — продуценэа D агарозном геле. Отбирают клоны, не тз фибринолизина. выросшие на среда с тетрациклином, лизи- Лизированную смесь ДНК плазмид исрующие фибрин и содер>кащие плазмидную 15 пользуют для трансформации клеток E. coll

ДНК с меньшей подвижностью, чем по- К802 А с18578т:Сгп. Трансформированные движность ДНК pBR322, Наличие нужной клетки подращивают 1 ч в бульоне LB npu вставки подтверждают наличием сайтов ре- 28 С и высевают на агаризированную среду стрикции на плазмидной ДНК анализируе- . сампициллином(20мкг/мл) ихлорамфенимого клона для рестриктаэ Крп1 и Bgl11, 20 колом (25 мкг/мл). Продукцию фибринолиимеющймся только на Hlnd111-Ява1фраг- зина определяют на плотной среде с менте ДНК pPst. Плазмидная ДНК, состоя- фибрином. Трансформанты пересевают на щаяиэкрупногоН1пд111-ЕсоЙЧфрагмента, плотную среду с фибрином выращивают рВЙ322 и малОго Hlnd1111-Sma1 фрагмен- сутки при 28"С, затем проводят индукцию та pPst, обозначена рЕК4, а клон Е. coll 25 при 42-44, С 30 мин и инкубируют посевы

KS02, несущий гибридную плазмиду рЕК4, 1-2 ч при 37 С. Вокруг колоний проявляютотобран как донор данной плазмиды, ся зоны просветления, свидетельствующие

Г. Конструирование гибридной плазми- о том, гго клоны содержат плазмиду с вставды ðÅÊ8.. кой, содержащей детерминант синтеза фибИэ клеток клона Е. со11 К802, содержа- 30 ринолизина под контролем сильного щего плазмиру рЕК4, известными методами терморегулиру6мого промотора Pl. фага Л . (см, выше этап Л) выделяют плаэмидную - В. Тестирование фибринолитической

ДНК, регистрируют ее (10 мкг) Есой1 и Pst1 активности в супернатанте Е, coll К802 рЕК8 ферментами в высбкосолввбм: буфере (100 А.с18573т: Cm.

MM NaCl, 50 мМ трис-НС!, рН 7,5, 10 мМ 3!ý ОтдельнуюколониюштаммаЕ.со11К802

МцС1, 1 мМ дитиотрейтол) при 37 С 1 ч. рЕК8Ас18573т:Сазасеваютв50млбульона

Продукты гидролиза (2 фрагмента) разделя- LB и инкубируют с аэрацией при 28 С 18-24 ют и извлекают больший (4,9 т,п.н.) фраг- ч (Д600 0,9). Индукцию синтеза проводят мент как описанб выше, ДНК плазмиды при 42-44 С 30 мин, затем продолжают

pLC24 (10 мкг), выделенную из штамма Е, 40 культивированиесаэрациейпри37 С5-6ч. . со11К802(р1 С24),темижеметодамиподвер- Клетки кишечной палочки осаждают при гают гидролизу рестриктазами Есой1 и 10000 об/мин, 4 С 15 мин, Супернатант ocPst1. Отбирают меньший иэ двух получен- торожно сливают и фильтруют через нитроных фрагментов (1,3 т,п.н,). Очищенные целлюлоэный фильтр (Шляйхер и Шулль фрагменты смешивают, осаждают 96% зта- 45 диаметр пор 0,22 /(м), 50-100,и l супернанолом, промывак>т 70 этанолом и лигиру- танта наносят на плотную среду с фибриоei в условиях, идентичных описанным в ном и:инкубируют при 37 С, Через 24 ч на месте нанесения супернатантв образуется

Пример 2. Л, Получение штамма Е. coll зона просвеления, Уровень продукции фибК802, лиэогенного по фагу А с18575тСт. 50 ринолиэина в оптимальных условиях для роНочную культуру Е. coll С600 ста клеток-продуцентов Е. coll составляет

Ас1857Ят;Ст, выращенную при 28 С, засе- 20-30 мг/л, вают в бульон LB (1.50), инкубируют с аэра- Предлагаемое изобретение позволяет цией 1,4 ч при 28 С. Резко повышают выделитьфибринолизинчумного микроба в температурудо42-44 С и аэрируют 25 мин, 55 препаративных количествах иэ среды кульзатем при 37 С подращивают еще 2,5 ч. тивирования, что значительно облегчает

К ультуру центрифугируют при 8000 об/мин этапы очистки фибгилнолиэинл. Получен

15 мин, осадок суспендируют в 1/50 обьема штамм-продуцент Е, only .; ибридной плаз0,02 М Мц804 и лизируют смесью хлоро- мидой рЕКО, обеспечиввкнций синтез фиб1751206

7, ринолйзина. Гибридная плазмида рЕК8 многОкопийная, обладает селективным мар-. кером"-"-устойчивостью к ампициллину. Уровейь синтеза фибринолизина находится под контролем сильного терморегулируемого Р промотора фага 1 До настоящего времени в литературе не описано койструирование штамма кишечной палочки — продуцента фибринолизина, секретйрующего фибринолизин в среду культивирования.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

1. Рекомбинайтная плаэмидная ДНК рЕК8, кодирующая фибринолиэин Yerslnla

pestls размером 6,2 тл|,н., содержащая — Pstl — EcoRl —. фрагмент .векторной

ДНК pLC24 размером 1,3 т.п,н:., с PL промотором фата k — EcoRI - Hind Ш вЂ” фрагмент размером

29 т, п.н, и EcoRV — Pstl — фрагмент римером 3,4 т.п.н. вектора pBR322 с Ыа-геном," — Hindi ll — Smal — фрагмент йлаэмиДы

pPst размером 1,45 т,п.н. с fib-геном, гвнетическйе маркеры, гены и регуляторные элементы, — Ь!а-ген, обеспечивающий синтез

Р -лактамаэы и устойчивость к ампициллину - fib-гей, обеспечивающйй синтез фибринолизина чумного микроба — Р промотор фага А;

- сайты рестрикции. по. одному участку распределения Kpnl, Есой!, Hindlll, Smal и два участка расщепления эндонуклеазой 8am Hl.

2. Способ конструирования плазмидной

5 ДНК рЕК, кодирующий фибринолиэин

Yersinla pestls, з а к л ю ч а ю шийся. в . том, что ДНК плазмиды pPst подвергают совместному тидролизу .зйдонуклеаэами

Hlridtll и Ява), выделяют Hindlli — Smal

10 фрагмент размером 1,45т.п.н„ДНК плазмиды pBR322 подвергают совместному гщ ролиэу эндонуклеазами Hindlll и EcoRV, выделяют Hlndlll - EcoRV фрагмент разме,ром 4.2 т.п.н„затем смесью рекомбинант15 ных молекул т ран сформируют клетки

Eschhrlchla coll К802, трансформанты высе:. вают на среду с ампйциллином и иэ выросших клойов выделяют плазмидную ДНК, содержащую Ыа- ген, и fib-ген, затем пол20 ученную ДНК гидролйзу1от эйдонуклеазами

EcoRl и Pstl, выделяют EcoRI-= Pstl фрагмент размером 4,2 т.п.н. и соединя от ДНК лигаэой с EcoRl — Pstl-фрагментом разме ром 1,3 т п.н плазмиды pLC24, Содержащим

25 P j йромотор:и полученным в результате гид- . ролиза ДНК pLC24 эндонуклеаэами ЕсоМЪ

Pstl, после ":трайсформации клеток Е, coll

К802 Ас185787:Cm отбирают клоны, обладающие йовышенйой способностью продуци30 ровать фибринолизин: при повыйении темперзтурй до 44 С.

3. Штамм бактерий Escherichla coil КМ-9продуцейт фибринопизина Yerslnla pestts.

4

Составитель Е.булгакова

Редактор Н.Швыдкая Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С.Пекарь

Заказ 2665 Тйраж Подйисное

ВНЙИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород. ул.Гагарина, 101