Способ обнаружения вирусов

 

Использование биотехнология, вирусология , способы обнаружения и тестирования вирусов Сущность изобретения к вируссодержащей пробе добавляют желточные антитела, которые затем обрабатывают ультразвуком с частотой 22-44 кГц в течение 30-45 с. Затем пробу инкубируют в течение 30-60 мин при 37°С, после чего к ней добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации 1-3% и инкубируют в течение 12-18 ч при 4°С с последующим центрифугированием и электронно-микроскопическим исследованием осадка По сравнению с известным способом чувствительность увеличивается в 10-15 раз

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s 6 01 N 33/52

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

: ::у-„,, ..», 1

1 (21) 4790303/13 (22) 09.02.90 (46) 30.07.92.Бюл, йг 28 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов AMH СССР (72) В.Г,Литовченко и В.И,Хаустов (56) Almeida 1,D„Waterson А.Р, The.

morphology of virus — antibody infection Adv.

virus. Res, 1969, v. 15, р. 307-338. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ. (57) Использование: биотехнология, вирусология, способы обнаружения и тестироваИзобретение относится к биотехнологии. а именно к вирусологии. и может быть использовано для тестирования вируссодержащих полуфабрикатов и вирусных препаратов.

Для анализа вируссосодержащих материалов применяют различные методы, в частности метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ обнаружения вирусов, включаюший инкубацию вируссодержащей суспенэии с кроличьей специфической имунной сывороткой в течение 30 — 60 мин при 37"С с последующей инкубацией этой смеси в течение

12 — 18 ч (второй этап инкубации) при 40С.

Затем эту суспензию центрифугируют при

12000 — 15000 xg в течение 60 — 90 мин. Осадок ресуспендируют е 0,05-0,1 мл 1-3 -ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH 6,8-7,2) и наносят на сетку с пленкой-подложкой иэ формвара, укрепленной углеродом. Приготовленные препараты

„„SU„„1751679 А1 ния вирусов. Сущность изобретения: к еируссодержащей пробе добавляют желточные антитела, которые затем обрабатывают ультразвуком с частотой 22 — 44 кГц в течение

30 — 45 с. Затем пробу инкубируют в течение

30 — 60 мин при 37 С, после чего к ней добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации 1 — 3;4 и инкубируют в течение 12-18 ч при

4 С с последующим центрифугированием и электронно-микроскопическим исследованием осадка. По сравнению с известным способом чувствительность увеличивается в

10-15 раз, исследуют с помощью электронного микроскопа, Недостатком известного способа является его относительно низкая чувствительность.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа

Способ осуществляют следующим образом.

В вируссодержащую суспензию, взятую в объеме 0,8 мл, вносят желточные антитела в количестве 0,2 мл (в разведении 1:400).

Желточные антитела против вируса полиомиелита (ВПМ) вакционного штамма Себина типа 1 изготовлены в.ИПВЭ AMH СССР, По аналогичной технологии готовили антитела против ротавирусов обезьян (PB) штамма $А-11 в лаборатории электронной микроскопии и патоморфологии названного института путем иммунизации кур вирусными антигенами с последующим выделением антител из желтков яиц. Титры антител перед .исследованием определяют иммуно1751679 ферментным методом и отбирают препараты с титром не ниже 1:10 000, Формула изобретения

Способ обнаружения вирусов, включающий добавление к вируссодержащей суспензии специфических антител, двухэтапную инкубацию, центрифугирование и электронно-микроскопическое исследоваwe ресуспендированного осадка, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из антител используют желточные антитела, перед первым этапом инкубации суспензию с антителами обрабатывают ультразвуком с частотой 22 44 кГц в течение 30 45 с, а перед вторым этапом инкубации в суспензию вносят полиэтиленгликоль в концентрации 1-3%, Составитель В,Литовченко

Техред ММоргентал Корректор Л.Филь

Редактор АЛежнина

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

ПроиЗводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

После внесения в вируссодержащую суспензию (исследуемую пробу) антител ее 5 подвергают обработке ультразвуком с частотой 22 44 к Гц в течение 30 — 45 с однократно. Затем суспензию инкубируют при 37 С в течение 30-60 мин (1-й этап инкубации), добавляют к ней 50 -ный раствор полиэти- 10 ленгликолч (ПЭГ) до его конечной концентрации 1 — 3% и повторно инкубируют при 4 С в течение 12-18 ч (2-й этап инкубации). По окончании инкубации суспензию центрифугируют при 12000-15000 xg в течение 60 — 90 15 мин, осадок ресуспендируют в 1-3 -ном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) рН 6,8-7,2 и наносят на сетку с пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом. Приготовленный аким образом 20 препарат исследуют с помощью электронного микроскопа.

Пример 1. К 0,8 мл суспензии ВПМ с титром 4,0 Log БОЕ/мл добавляют 0,2 мл специфических желточных антител (в разве- 25 дении 1:400), Затем эту суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 22кГц в течение 30 с однократно и инкубируют ее при 37 С в течение 30 мин, после чего к, суспензии добавляют ПЭà — 6000 до его ко- 30 нечной концентрации 1 и повторно инкубируют при 4 С в течение 18 ч, Затем суспензию центрифугируют при 12000 xg в течение 60 мин, а осадок ресуспендируют в

1%-ной ФВК рН 6,8 и наносят на сетку с 35 пленкой-подложкой из формвара, укрепленной углеродом. Препарат исследуют с помощью электронного микроскопа. В исследуемой пробе было определено 10 ви- русных частиц/мл, . 40

Il р и и е р 2. Количество вирусных частиц в суспензии, содержащей ВПМ, определяют аналогично примеру 1 з* исключением того, что суспензию вируса после добавления к ней антител обрабатывают ультразвуком с частотой 44 кГц в течение 45 с, а после второго этапа инкубации добавляют ПЭГ-6000 до конечной концентрации 3%.

В исследуемой пробе было обнаружено 10 частиц/мл, Пример 3. Количество вирусных частиц в суспензии, содержащей PB с исходным титром 10 ТЦД5о/мл, определяют

4 как описано в примере 1, В исследуемой пробе было найдено 10 вирусных частиц/мл, По сравнению с прототипом чувствительность предлагаемого способа обнаружения вирусов возрастает в 10-15 раз, Так, минимальная концентрация вирусных частиц, выявляемая по прототипу, в случае

ВПМ составила до 10 вирусных частиц/мл6 а пои использовании предлагаемого способа — 10 вирусных частиц/мл; в случае РВ

5 обезьян соответственно по прототипу — до

10 вирусных частиц/мл, а с использованием предлагаемого способа — до 10 вирусных.

5 частиц/мл.