Способ определения липополисахаридных антител против грамотрицательных микробов

 

Изобретение относится к области медицины , в частности инфекционной иммунологии , и может быть использовано для определения антибактериальных противолипополисахаридных антител (ЛПС-антител ). Целью изобретения является повышение точности рпособа определения ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА или для приготовления диагностикума для РПГА используют ЛПС из Ремутачта Salmonella rninnesota, не содержащий примесей с чистотой содержания гексозаминов, Изобретение можно использовать на производстве препаратов крови для отбора сывороток с высокими титрами ЛПС-антител, которые можно применять для лечения септических больных. Изобретение может быть использовано и для наблюдения в динамике за септическими больными, что представляет ценность ввицу быстроты получаемого ответа 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з 6 01 И 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4865648/14 (22) 10.03,90 (46) 30.10,92. Бюл. М 40 (71) Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского (72) Л,M. Яровая, В.А. Алешкин, Е.В. Симонова и И.Л. Гофман (56) Saffin St. et а1, Vox. Sang

1986, 48, р. 276-283, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ (57) Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано для определения антибактериальных противолипополисахаридных антител (ЛПС вЂ” антиИзобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано для определения антибактериальных противо.липополисахаридных антител (ЛПС-антител), Тяжелые токсические состояния и токсические шоки при бактериальных инфекциях и сепсисе связаны с разрушением бактерий и освобождением зндотоксина.

Антибиотики, которые широко применяют при серьезных грамотрицательных инфекциях, вызывая разрушение бактерий, способствуют освобождению эндотоксинов, попаданию их в кровь и ухудшению состояния больных.

Эндотоксины грамотрицательных бактерий имеют сложную структуру и состоят из белка и ЛПС. ЛПС условно разделяют на

/,„,5Ц,„, 1772759 А1 тел). Целью изобретения является повышение точности способа определения ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА или для приготовления диагностикума для РПГА используют ЛПС из Ремутачта Salmonella minnesota. не содержащий примесей с чистотой содержания гексозаминов, Изобретение можно использовать на производстве препаратов крови для отбора сывороток с высокими титрами

ЛПС-антител, которые можно применять для лечения септических больных. Изобретение может быть использовано и для наблюдения в динамике за септическими больными, что представляет ценность ввиду быстроты получаемого ответа 1 табл. три части: 0-специфическая часть, кор и липид А. 0-специфические цепи различных видов бактерий сильно отличаются друг от друга по химическому строению и этим определяют серологическую специфичность.

Кор и липид А у различных видов грамотрицательных бактерий имеют подобные структуры. В настоящее время для всех энтеробактерий описано 6 кор-типов (R > — R4, К вЂ” 12 Е.coll тип и Ra-тип Salmonella, отличающихся вариабельностью строения наружной части, проксимальной к О-цепи.

Внутренняя область кор, проксимальная к липиду А, имеет более общее строение. Липид А является наиболее консервативной частью молекулы и представляет собой дисахарид, состоящий из двух глюкозаминовых остатков, к которым присоедины цепи жирных кислот, фосфат и этэноламин. В на1772759

10 стоящее время детально установлена структура двух типов липида А: Coll-тип и

Яа!еопеИа-тип. Однако авторы предполагают наличие 4 типов липида А, другие сообщают о микрогетерогенности молекул липида А, различающихся по количеству цепей жирных кислот и количеству замещений фосфатом и этаноламином.

Липид А с укороченной частью кор, состоящей из двух молекул КДО (2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота) встречается в структуре ЛПС практически всех грамотрицательных микроорганизмов. Именно эта часть молекулы ЛПС отвечает эа токсичность эндотоксинов. Липид А нерастворим в воде, э присутствие двух молекул КДО кор-области делает его молекулу водорастворимой. Такое строение ЛПС (липид А+ 2 молекулы КДО) обнаружено s Йе-мутантах бактерий, которые утратили некоторые ферменты и поэтому неспособны включать Оспецифическую цепь и значительную часть кор в ЛПС.

Антитела к ЛПС из S-форм бактерий при парентеральной иммунизации животных образуются только к О-специфической цепи, но не к кор или липиду А и поэтому не могут нейтрализовать токсическое действие кор и липида А. Парэнтеральная иммунизация ЛПС кор-дефектных мутантов Ra-Rd вызывает образование антител, специфичных к терминальным углеводным остаткам, а антитела против субтерминальных и глубоких структур кор или липида А не образуются. Наибольший практический интерес в плане перекрестной защиты представляют антитела к липиду А и ЛПС Re-мутантов, состоящему из липида А и двух молекул

КДО. структур, обнаруженных во всех грамотрицательных бактериях. Антитела, направленные против этих структур

Re-мутантов должны нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов всех грамотрицательных микробов. И при проверке оказалось, что среди всех испытанных антител к R-мутантам (Яе-Re) перекрестно защищать животных от гибели могли только антитела к Re-мутанту S. minnesota u Rc-мутанту Е. coll, За рубежом имеются данные по применению плазмы или сыворотки крови с повышенными титрами ЛПС-антител больным с токсимией и сепсисом. Смертность больных сепсисом составляет обычно

60 — 80%. Применение плазмы или сыворотки с повышенными титрами ЛПС-антител значительно увеличивает выживаемость больных при сепсисе.

Известен способ определения антител к ЛПС методом РПГА на основе диагностикума с "Re-гликолипидом" S, minnesota. Од15

50 нако, отобранные на его основе сыворотки крови обнаруживали слабый протективный эффект на мышиной модели. При иммунизации добровольцев кипяченым Re-мутантом

$. minnesota не обнаруживали повышения титров в "Re-гликолипиду", т,к. антиген был маскирован примесями.

Прототипом можно считать работу, в которой определение ЛПС-антител проводят методом ИФА. При этом используют ЛПС, полученный иэ S-форм бактерий по методу

Вестфаля, При таком определении ЛПС-антител имеется ряд недостатков: во-первых, с помощью ЛПС S-форм бактерий выявляются антитела к О-специфической цепи, принадлежащие к lgG-классу, которые являются специфичными для каждого вида и даже штамма микробов, во-вторых, антитела против кор и липида А, общие для грамотрицательных микробов, принадлежащие к

lgM-классу, не выявляются совсем, и, втретьих, используется недостаточно очищенный антиген, т,к. препараты ЛПС по

Вестфалю содержат примеси (до 3% белка и 3% нуклеиновых кислот), что затрудняет выявление ЛПС-антител. Сыворотки с повышенными титрами ЛПС-антител в работепрототипе были более эффективны в лечении сепсиса, чем иммуноглобулины

lgG-класса, полученный из них, так как основная защита от токсического действия

ЛПС связана с lgM классом антител.

Целью настоящего изобретения является повышение точности способа определения ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицэтельных бактерий антигена.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА используют ЛПС иэ Re-мутанта Salmonella minnesota, не содержащий примесей белка, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов (других, кроме липидэ А). О-специфической цепи, частей кар(кроме двух молекул КДО). Антиген

ЛПС из Re-мутанта может быть получен любым иэ известных методов получения ЛПС и затем доочищен, чтобы гарантировать отсутствие в нем примесей. Однако, препарат

ЛПС получают наиболее высокой степени чистоты, если выделение ЛПС из Re-мутанта проводят с фенол-хлороформ-петролейным эфиром по методу Galanos. Кроме высокой сгепени очистки препарата ЛПС этот метод гарантирует и хороший выход — до 5,5%, тогда как по методу Вестфаля выход — 0,6%.

Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и полисахаридов проводят любыми известными методами. Гарантией высокой степени чистоты ЛПС Re-мутанта служит содержание гексозаминов, равное 17% или 1030 нмо1772759 ля/мг(при высушивании до постоянного веса), что соответствует теоретически вычисленным.

Наличие примесей в препарате ЛПС наиболее быстро контролируют высокочувствительным методом с карбоцианиновым красителем (7) по визуальному изменению цвета и сдвигу максимума поглощения в видимой части спектра, указывающего на присутствие белка, нуклеиновых кислот или полисахаридов, Антиген, полученный по методу 6а1апоз хорошо растворялся в воде, хорошо сорбировался.на планшеты для ИФА и после обработки щелочью хорошо сорбировался на эритрацитах при приготовлении диагностикума, Использование этого антигена в ИФА доказывает, что ан выявляет антитела igMкласса, т.к, работы системы требуются коньюгаты антител к IgM-человека.

При выделении из антигена липида А получают нерастворимый препарат, использование которого в качестве антигена усложняет способ, т.к, ведет к необходимости перевода липида А в растворимую форму, Постановку ИФА осуществляют обычным образом.

Пример 1. Определение содержания

ЛПС-антител на основе ЛПС Re-мутанта S.

minnesota методом ИФА.

Высушенную спиртом микробную массу Re-мутанта S, minnesota трижды экстрагируют смесью 90 (фенал (свежеперегнанный)-хлороформ-петролейный эфир (кип, 40 — 60 С) в соотношении

2:5:8. Объединенные надосадочные жидкости упаривают в роторном испарителе для удаления хлороформа и петролейного эфира. К оставшемуся фенолу, начинающему кристаллизоваться, добавляют воду да полного его растворения. Далее воду добавляют по каплям до выпадения в осадок ЛПС, соблюдая осторожность, чтобы не вызвать расслоения фенола избытком воды, Осадок

ЛПС собирают центрифугированием, промывают 80 7, феналам и трижды эфиром, досушивают в вакууме.

Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и палисахаридав проводят карбоцианиновым красителем па определению максимума поглощения антигена в видлмай части спектра. Антиген имел максимум поглощения г1ри

467 нм, чта свидетельствовало об отсутствии примесей, и превышал процентное содержание ЛПС в стандартном препарате

ЛПС из Е= соН 055: В5 фирмы "Difco", США, полученному по методу Вестфаля.

В препарате ЛПС определяли содержание гексозаминав. которое оказалось рав5

55 ным 17".:, на сухой вес препарата. Такой высокоо-ищенный препарат был использован в ИФА в качестве антигена для нанесения на планшет или для приготовления диагностикума для постановки РПГА, При постановке ИФА способ осуществляют следующим образам: очищенный антиген наносят в рабочей концентрации 5 мкг/мл в лунки полистироловых планшетов для ИФА в объеме 0,2 мл, В качестве сарбирующего буфера используют 0,05 Ы карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6, Сенсибилизацию пластин проводят в течение 16= 20 часов при температуое 4 С, после чего отмывают фосфатно-буферной смесью, содержащей 0,05 4 твин-20. Затем наносят исследуемые образцы сывороток крови, или препаратов иммнуноглобулинав, или осадка Б, получаемого при фракциониравании сывороток крови по метод. Кона (фракция

Ш} в разведении 1:50 — 1:1600, после инкубации отмывают и наносят коньюгат антител к иммуноглсбулину M человека с пероксидазай хрена. Время инкубации сывороток и конъюгата — 1 и,5 ч при 37 С, После отмывки ферментативную реакцию проявляют, добавляют субстрат, содержащий 0,003%

Н202 и 0-фенилендиамлн (ОФД} в 0,05 цитратно-фосфатнам буфере рН 5,0, Через 30 мин стояния реакцию фиксируют добавлением 14О НзЯО4 и учет интенсивности окрашивания проводят на фатаметре "Т ;егтЖ

Mvltlskan" при 492 нм, Методом ИФА обследована 34 пулевых сывороток крови обьемом па 5 л. слитых ат

30 — 40 индивидуальных порций. !!ç H!Ix — 13 донорских и 21 плацентарные сыворотки. из

17 городов РСФСР, поступ= þùèõ на предприятие ВНИИЭМ им. Г,Н. Габричевского для фракцианиравания па методу Кона. Результаты титравания обнаружили содержание ЛПС-антител в пулавых сыворотках в титрах от 1:50 до 1;1600. Стабильно высокие титры обнаружены в пулавых сыворотках из г. Ленинграда (титр 1:800 в 6 из 7 исследованных абразцав), на втором месте па высоте титров оказались пулавые сыворотки из г, Пскова (титр 1;400 в 2 из 2 образцов). В образцах сывороток из г. Архангельска титры 1:200 были обнаружены в 3 из 4 исследованных, а в образцах из г, Смоленска — 1 образец 1:200, другой 1:1600.

При анализе заболеваемости острыми кишечными инфекциями неустановленной этиологии, дизентерией и сальманеллами за последние 2 года именна в этих городах отмечена высокая частота забалеванил, а высокие титры антител к кар и липиду А сохраняются в течение 2-" лет, Следовательно. именна сываратачнсе сырье из ме1772759

50 стностей с высоким уровнем заболеваемости, вызванной грамотрицательными микробами, можно рассматривать как источник для получения иммуноглобулиновых препаратов направленного действия, Пример 2. Определение содержания

JlflC-антител в РПГА с диагностикумом на основе ЛПС иэ Re-мутанта S. mfnnesota, Диагностикум для постановки РПГА готовят следующим образом . 5 мг антигена обрабатываю 1,25 мл 0,02 М раствора

NaOH при 37 С в течение 16 ч, после чего нейтрализуют 0,02 М раствором HO и доводят обьем до 10 мл физраствором, после чего смешивают с 1 мл плотного осадка отмытых физраствором свежих эритроцитов.

Смесь инкубируют 2 ч при 37 С периодически встряхивая, после чего эритроциты 3 раза отмывают физраствором и доводят обьем до 50 мл.

Методом РПГА обследовали 34 пуловых сыворотки, 12 осадков Б и 10 индивидуальных сывороток от больных пиелонефритом. Во всех исследованных образцах обнаружены ЛПС-антитела в титрах от 1:80 — 1:640. Определения РПГА проведены параллельно с методом ИФА в одних и тех же образцах и обнаружено значительное совпадение результатов титров (расхождение между РПГА и ИФА не боле, чем в два раза).

Результаты определения содержания

ll flC-антител на основе предлагаемого антигена-ЛПС из Re-мутанта S. mlnnesote методами ИФА и РПГА в 10 индивидуальных сыворотках больных пиелонефритом приведены в таблице в сравнении с О-специфическими антителами, определяемыми с коммерческими ЛПС из S-форм микробов.

Из данных таблицы видно, что содержание О-специфических антител не всегда коррелирует с содержанием анти-Re-ЛПС-антител в сыворотках крови у индивидуальных больных. Эта разница стирается при сравнении пуловых сывороток и осадков Б, РПГА проще в исполнении, чем ИФА, но менее экономична, т.к. расход антигена в 100 раз больше, Технико-экономическая эффективность изобретения.

Изобретение может быть использовано для определения состояния иммунной системы в динамике у больных серьезными грамотрицательными инфекциями и сепсисом. Нарастание ЛПС-антител у таких больных свидетельствует о том, что иммунная система больного справляется с инфекцией и отвечает выработкой антител. Уменьшение ЛПС-антител у больных сепсисом — плохой прогностический признак, приближение летального исхода.

Изобретение может быть применено для обследования нанесения для выявления группы риска, со сниженными титрами

ЛПС-антител, лиц, которые могут погибнуть от сепсиса. Особенно велик будет процент таких у подвергшихся радиоактивному облучению.

Можно использовать изобретение и для выявления лиц с высокими титрами ЛПС-антител, которые могут быть донорами крови; так как такие Re-ЛПС-антитела сохраняются в организме в течение 2-3 лет на высоком уровне.

Изобретение может быть использовано на производстве препаратов крови путем отбора сывороток с повышенными титрами

Re-ЛПС-антител и изготовления из них иммуноглобулиновых препаратов Ig M-класса, эффективных в лечении токсемий и сепсиса, вызванного любыми грамотрицательными микробами.

Показано, что дяя этих целей может быть использован бросовый осадок Б, получаемый при фракционировании крови по методу Кона, а кровь для фракционирования следует брать иэ местностей с высоким уровнем заболеваемости за последние 2-3 года, вызванной грамотрицательными микробами.

Формула изобретения

Способ определения липополисахаридных антител против грамотрицательных микробов, включающий выделение антигена, нанесение его на носитель, внесение исследуемой сыворотки и учет иммунологической реакции при иммуноферментном анализе, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа эа счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена, в качестве антигена используют Re-мутант Salmonella mlnn ota при уровне содержания гексозаминов 17;ь:

1772759

** — Коммерческий О-диагностикум, Составитель Г.Крюкова

Техред M.Моргентал Корректор Н.бучок

Редактор

Заказ 3844 Тираж Подписное

В НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина. 101

* — В качестве антигена на планшет наносили коммерческий ЛОС иэ E.ñîÍ 055; В5, полученный по методу Вестфаля, фирмы " 0ifco." США.