Способ получения эритроцитарного диагностикума
Использование: медицина для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения. Цель изобретения - повышение чувствительности диагностикума. Сущность изобретения, проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде HBSAg или антителами гепатита В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% всвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57°С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава , мас.%: 0,3%-ный р-р СиЗОз 0,25-0,35; 0,2%-ный р-р К2СГ20 0,15-0,25; 0,1%-ный р-р СгС1з 0,07-0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5!)5 А 61 К 47/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 4928119/14 (22) 25.02 91 (46) 07.11,92. Бюл. N 41 (71) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР (72) Г.Н.Хорват и А.А.Арзанов (73) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР (56) Регламент производства иммунодиальостикума на HB анаренэритроцетарного иммуноглобулинового сухого. Н, 280-82, утвержден 08.04.82. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА (57) Использование: медицина для получения эритроцитарных диагностикумов разИзобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения.
Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для определения антител K австралийскому антигену в реакции пассивной гемагглютинации путем сенсибилизации отмытых эритроцитов О/1/ группы крови австралийским антигеном в присутствии хлорида хрома с последующим отмыванием сенсибилизированных эритроцитов в физиологическом растворе. при этом эритроциты сенсибилизируют антигеном в концентрации 40 — 60 мкГ/мл суспензии эритроцитов в присутствии 0,07...0,13%-ного раствора хлорида хрома и после отмывания через 3 — 6 ч сенсибилизированные.. Ы 1774872 АЗ личного назначения, Цель изобретения — повышение чувствительности диагностикума.
Сущность изобретения: проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде HBSAg или антителами гепатита
В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% взвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%: 0,3%-ный р-р CuS04 0,25 — 0,35;
0,2%-ный р-р К2СГ207 0,15 — 0,25; 0.1%-ный р-р CrCb 0,07 — 0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл, эритроциты обрабатывают 0,5...0,8%-ным раствором формалина при соотношении формалина и сенсибилизированных эритроцитов (0,24 — 0,28):1 (см. а.с. СССР N 715088, 1980).
Достигнутый в известном способе уровень чувствительности обнаружения антител у 89...90% больных сывороточным гепатитом не может быть признан достаточным при обследовании доноров крови, и не удовлетворяет практическое здравоохранение.
Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для определения антигена гепатита В, включающий сенсибилизацию 50%-ных формализированных эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде, 8\/) с иммуноглобулином
1774872 — 0,25...0,35 — 0,15...0,25
0,07...0,15
0,47....0,75
50 в присутствии конъюгирующего агента в виде 0,3%-ного о-ра хлорида хрома (СгС!з) при гемпературе 37...45 С в течение 30 мин с последующим отмыванием от несвязавшегося белка и хлорида хрома физиологическим раствором, добавлением защитной среды, состоящей из бычьего альбумина, буры, сахарозы и борной кислоты на дистиллированной воде, до образования 5% концентрации взвеси и, при необходимости, лиофильной сушкой (Регламент производства иммунодиагностикума на
НВз-антиген эритроцитарного иммуноглобулинового сухого" N 280-82, утвержденного начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР от 08.04.82).
Известный способ выбран авторами за прототип.
Имея широкое применение в отечественной медицинской поактике, известный способ не лишен недостатков, основными из которых являются следующие: — уровень чувствительности недостаточно высок (10...20 НГ) по сравнению с радиоиммунным методом, разрешающая способность которого составляет 1„.5 НГ; — повышенный расход дефицитного белка в связи с необходимостью использования глобулиновой фракции с титрам
1/128-1/256.
Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума.
Г)оставленная цель достигается тем, чт в известном способе получения эритроцитарного диагностикума, включающего сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии коньюгирующего агента с псследующим их отмыванием, добавление защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5% и лиофилизацию, сенсибилизацию проводят при 54—
57ОС, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас,%:
0,3% ный p-p CUSO4
0,2 jp-ный р-р K2CI207
0,1%-ный р-р СгС!з
Вода дистиллированная остальное
Температурный интервал, использованный в заявляемом способе, отличается более высокими значениями по сравнению с известными и активно интенсифицирует процесс сенсибилизации, при этом верхнее значение интервала (57 С) является предельным, так как его превышение вызывает распад белка, В то же время использование в качестве коньюгирующего агента смеси
CuS04, К2Сг20т, СгС!з не только усиливает связывающие (дубильные) свойства агента. но и предупреждает шлакообразование, снижающее частоту диагностикума и, следовательно, чувствительность его как при определении антигена, так и антител, Оптимальность состава смеси:
0,3%-ный р-р CuSO< 0,25...0,35
0,2%-ный р-р К Сг 07 0,15...0,25
0,1%-ный р-р СгС!з 0,07.„0,15
Вода дистиллированная остальное доказана экспериментально в процессе многочисленных исследований влияния каждого из ингредиентов смеси в различной концентрации в индивидуальном и совместных влияниях на связующую способность суспензий эритроцитов различного происхождения и концентрации. Суммарное действие отличительных признаков предложенного способа реализует в диагностикуме новый уровень чувствительности, сопоставимый с радиоиммунным методом.
Пример 1. К трижды отмытым в физиологическом растворе для удаления формалина 50% эритроцитам в объеме 0,5 мл добавляют восемь объемов дистиллированной воды (РН=2,0 — 2,5) и осуществляют сенсибилизацию добавлением одного объема риванольной гаммы с титром 1/16 — 1/32 и одного объема конъюгирующего агента в виде смеси следующего состава, мас,%:
0,3%-ный р-р CuS04 0,25
0,2%-ный р-р К Сг 07 0,25
0,1%-ный р-р СгС!д 0,15
Инкубацию осуществляют в термостате при 56 С. Время сенсибилизации 25 мин, После завершения сенсибилизации полученную смесь трижды отмывают физиологическим раствором от несвязавшихся белков и ингредиентов связующего агента, а затем добавляют известную "-ащитную среду до 5% взвеси эритроцитов и подвергают лиофильной сушке, Полученный диагностикум используют следующим образом: готовят физиологический раствор с концентрацией эритроцитов
2,5% и полученныйтестдобавляютк пробам крови доноров в следующей последоцательности: — в лунки иммунологического планшета вносят 25 мкл исследуемой сыворотки крови донора, предварительно разведенной 1:8; — в лунки планшета, заполненные разведенной сывороткой, добавляют 25 мкл теста (отмытых эритроцитов); — продолжительность реакции — 25 мин, При образовании в лунках видимого осадка в форме зонтика результат считается
1774872 положительным. Процент выявления
H BsAg среди обследованных доноров составил 7 — 8%, Пороговая чувствительность диагнбстикума, откалиброванная по параллельно по- 5 ставленным опытам с использованием радиоиммунного метода составила 1,0 — 0,5
НГ антигена, Результаты апробации приведены в таблице.
Пример 2, К эритроцитам, приготов- 10 ленным аналогично примеру 1, добавляют очищенный HBsAg в концентрации 0,1-0,2 мгl мл и сенсибилизацию осуществляют при температурном режиме и в присутствии конъюгирующего агента аналогичным при- 15 веденнным в примере 1. Время сенсибилизации 30 мин. После завершения сенсибилизации эритроциты обрабатываются аналогично примеру 1. Использование полученного диагностикума аналогично 20 примеру 1.
Пороговая чувствительность полученного диагностикума соответствует 0,5 — 0,25
МЕ. Частота выявления антител больных гепатитом В достигает 96 %, а у обследован- 25 ных доноров 27„.39, Результаты апробации приведены в таблице.
Анализ результатов, приведенных в таблице, свидетельствует о следующем: — чувствительность диагностикума, пол- 30 ученного предложенным способом, как на
HBsAg, так и на антитела, соизмерима с чувствительностью радиоиммун ного метода и превышает известные в 10...20 раз; — предложенный способ отличается ста- 35 бильностью и высокой степенью оптимизации параметров, — так снижение нижних пределов температурного интервала и PH раствора относительно оптимальных показателей указанных величин приводит к 40 спонтанной агглютинации, в то время как повышение верхних пределов тех же параметров относительно оптимальных показателей — к потере чувствительности, а при доведении PH раствора до 7,0 (аналогично прототипу) чувствительность диагностикума снижается до величины известного способа 10...20 ME (строка 3.2.6 таблицы); — повышение степени выявления
HBsAg и антител при массовых обследованиях доноров полученным в предложенном способе диагностикумом на 4...5 % наиболее социально необходимо и экономически целесообразно, так как предупреждает имеющие место в медицинской практике случаи сывороточного гепатита с одной стороны, и, с другой стороны, позволяет выявить заболевание на ранней стадии его; — предложенный способ гарантирует полученному диагностикуму повышенный (в
2 раза) относительно известного срок хранения и частичную экономию дефицитного белка, Формула изобретения
Способ получения эритроцитарного диагностикума, включающий сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии коньюгирующего агента с последующим их отливанием, добавлением защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5 и лиофилизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительностии диагностикума, сенсибилизацию проводят при 54 — 57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас. g,: 0,3 -ный раствор
CuSOa — 0,25 — 0,35; 0,2%-ный раствор
К Сг207 — 0,15 — 0,25; 0,1 g,-ный раствор
CrCia — 0,07 — 0,15; вода до 100.
1774872
I
I
1 0
I С
1 R
6 д 3 с а с
z с
C уу
Е I
Л В
z C (v e
z Й
00 ле е л
Yeech
8z е». оод
5 а с а и
t4
6 л С
lO X х е
С С С есис
Ы Е 9 Се
895У с с с
95ее са а
1 I
t4 Z
Ф 6
1 1
1 1 °
4 I 1
-0 (Ч Ф б 6 °
1 Ф (ч
l l
I I м ю
1 I I
6 б 1
I (Ч 1
I 1 1
ЧФ 1 I 1 I
I I
I Z
1 1
1 Ф
I 1
1 Z I
Ф Z I
3 Э 1 (9
tt I с
Ф е 1
3 1 т 3
1 1
I 3сд
1 z
I Ю 3
1 0 I
6 f 3
1 1
1 З 1
1 0 ю»
1 д 1
С 1
1 Л 1
I 63 1
I 0 1
1 а 1
1 3
I б
Ф
LAsO CX Я С
CO ЮЧ LA ло л
1 ° 1 о о о лоо ъа (ЭЪ
6 (Ч
1 6 1 О\! ! 6 1 1 1 1
3 IO
3 9
О 1
St e
9 I 63 5 и
Л
l! I Z б ю а
u1 о
0 1 Ф
Л 1 С а
*ю
I IO
° 6 Ll(1 бч О
93 O(es(A t
1 1 1 1 сд лО 44
I 1 6 I
IA (Ъ
t»
° Ч юч
I а ь (ч
° I
Р(а
1 1 1 3 I
1 I 1 ао с
6 9(Л сб I t4
О 1 о -а
° 4 tAC4 оао к е (Ч ° Ъ 3
z и(а (ч 9 ао S
VL
С3
С
L е
1 I 1 1
В 1 В (Ч
Сб
LA
Cl (чма
ООО 6.
1 1 1 аао е оо с и! 1 1 1 I
3 1 I
«It(1 або (\
X д (ъ дд 4
1 - CLtv
1 S 3
cs acs
t (ALA сю о (ч
О ОООО
t» IA IA о оюч оооо
ОО l
С3 о о д л х о
1 б (ч
1 46 3
I ts aCt
LA LA (Ч «(4 Р \ о оооо аа (ч м оооо (Ч ФЧ
О!О
t4 (Ч
О!О
l3.
I (ф дд
l м аМ о асб
lA LA
Ъ (Ч (At(4t о оооо аа (Ч МРЮ Э сэ о о сэ (ъм
ОО мм
ОО (Ъ
I
1 0 а
1 Cl с ф х
3 0 Я! 8) 1
I (4
О
I о а (ч
° (Ъ 3
»
I! I I
I 1 I
1 I I
1 3
t 1 1
1 1! 6 1 ! 1 1
I e
Д Я л с
0 (Я е и а х
I e 0
С и
3 I и и
I и Ф а z
0 а
3I Ы
I e e
a Y
I fO 1
3(3.
lA (ч
Cl (Ч б ч\ м л о
I I б
3 t 1
3 Ф
1 I I б ° 1
1 1
1 1 I 1
Ъ
1 1 1
I л а
3 I 1
1 I 1
1 В
3 1 1! 6 1 1
В I I В
1 I 1
1 В °
° 1 1 °
lA (Ч 1
LA (Ч
1 1 б ! 1 I
1 I I
1 1 1
I i 1
I 3 I
6 I 1
V о
lA 1
1 1 3
1 Ф I
1 1
1 1 б
Э 1
I 1 В
I б I
1 1 6
3 з
I Z
Z 6e z (с е
Z 0
Л L аа 4
C CC ай z ао с
6l C Z лvc.
I Y
e g (ч (Я с асМ (tl L с е
ЛС
Ы Л с» z
1 ф Л
1 1 l I I
0 В 6 9 1
I 0 X б Л О X 1
Yet- (vzuz 1 аасбs.V 0с 9И
t Y 93 F Р*
9ZC l XZVЗ
9ze (o„z
L3ZY l ЕСЧС I — -4 ааб 00
9 3
Чб ЕЕРР ею
1 Ф !
Cl ZZ 1
Zl 00 1
et gxx
С (. I 1
O (-(— "- — 3
1 с з I
1 Я X
X 1 Ф 1
3 Лййй !
3 — — 4
1 1
1 1 Ь вЂ” 3
et 07
OI 6ЛС
Z Z XL
Yt 90021 л
3- — — — (I
3
I
I
6 !
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Ф
I
I б
I !
I
4
1
1
I
6
1
1 (1
I
1
1
1 C
Ф е
1 а !
I X а
6 IO
r (z
1
1 ! дд ю о
s to
I Я
1 Z
1
1 ф
6 (O
Л ю ч
В
1 Ol
13
В 36
t l ч
I
1 дд
1 V б
1
v
l и
1 Е
3 Е
3и ,s
I
1
