Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, - продуцент моноклональных антител против j @ е человека

 

Использование: биотехнология, медицина . Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоцитов инбредных мышей SJLAT. иммунизированных миеломным IgE, с клетками миеломы 653.А. Клетки штамма поддерживают в культуре в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скога, или перевивают на мышах-гибридах F1 (SjL/Jlx BALB/c). Обратный титр МКА в культуральных жидкостях составляет 1-21 тыс., а в асцитах - 100-600 тыс. Моноклональные антитела (МКА) относятся к lgG2a. При иммобилизации на твердой фазе МКА могут использоваться в паре с другими IgE - специфичными мечеными антителами в двухдетерминантном иммунометрическом тесте определения содержания IgE. МКА сохраняют антиген-распознающую способность при присоединении ферментной метки и пригодны в качестве меченого реагента для определения концентрации IgE в двухцентровом методе иммуноанализа. Штамм обозначен РИ-8Е/5Д4 и депонирован под номером ВСКК (П) 403Д.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистических

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4932011/13 (22) 25.03.91 (46) 23.11.92. Бюл. N. 43 (71) Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт (72) В,Б.Климович, М,П.Самойлович, В.Б.Гервазиева, И.Ю.Куртецкая, И.Г.Овсянникова, С.Ф.Пашкова и Т.Б.Полищук (56) Цыциков Ж. и др. Биотехнология, 1988, т. 4, 3,357. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ 16Е ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоцитов инбредных мышей SJL/T, иммунизированных миеломным igE, с клетками миеломы

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства моноклональных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используются в иммунохимической диагностике аллергических заболеваний человека.

Содержание Ig E в крови человека в 10-50 тысяч раз меньше уровня иммуноглобулинов других классов (lgA, IgG, lgM). Селективность и чувствительность современных методов выявления аллерген-специфических lgE-антител (аллергосорбентный тест) или определения общегосодержания tgE(двухдетерминантный иммунометрический тест) обеспечиваются реализацией принципа твердофазного иммуно-анализа, согласно,,5U 1776691 А1

653.А. Клетки штамма поддерживают в культуре в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, или перевивают на мышах-гибридах F1 (©Ц х

BALB/с). Обратный титр МКА в культуральных жидкостях составляет 1-21 тыс., а в асцитах — 100-600 тыс. Моноклональные антитела (МКА) относятся к IgG2a. При иммобилизации на твердой фазе МКА могут использоваться в паре с другими Ig E — специфичными мечеными антителами в двухдетерминантном иммунометрическом тесте определения содержания!9Е. MKA сохраняют антиген-распознающую способность при присоединении ферментной метки и пригодны в качестве меченого реагента для определения концентрации lg Е в двухцент- ) ровом методе иммуноанализа. Штамм обозначен РИ-8Е/5Д4 и депонирован под номером ВСКК (П) 403Д, которому lgE, содержащийся в исследуемом образце, связывается иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминант эпсилон-цепи, после чего сформированный на твердой фазе иммунный комплекс выявляется с помощью BTDрых МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку (1).

В связи с этим МКАТ, предназначенные для использования в аллергодиагностических методах твердофазного иммуноанализа, подвергаются отбору по критерию сохранения функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и ковалентном связывании с маркерными молекулами, Кроме того, при этом отбирают МКАТ, 1776691

10 I5

30

40

50 специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи, которые,во-первых,не маскируются при формировании комплекса аллерген-1аЕ. а во-вторых пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за связывание igE npu постановке двухдетерминантного иммунометрического теста. Перспективными для практического применения считаются

МКАТ, обладающие одним или несколькими из перечисленных свойств.

Известны гибридомные штаммы (2, 3.

4), вырабатывающие МКАТ против IgE человека (табл. 1).

В. числе аналогов описано семейство гибридомных клонов (5), при получении которых реализованы упомянутые выше принципы отбора продуцентов (ПРОТОТИП), Гибридомы получены на основе миеломной линии Р3Х63, Ag8.653 и лимфоцитов мышей линии ВА В/с, иммунизированных миеломным IgE человека. 5 штаммов этого семейства продуцируют МКАТ, относящиеся к

IgG1, продукты двух других штаммов относятся к Ig62a. Среди описываемых штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаимодействуют как с гомогенным (миеломным), так и с поликлональным IgE человека, что дает основания считать их специфичными в отношении константной области эпсилон-цепи. Продукты 2-х штаммов сохраняют энтиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных выявлять аллергенспецифические IgE-антитела или служить основой меченого реагента для двухдетерминантного определения концентрации

IgE, среди продуктов данного семейства гибридом не описано.

Недостаток известных гибридом, в том числе и прототипа, состоит в том, что для их получения в качестве родительских клеток использованы миеломные клеточные линии с низкой автономностью роста, требующие для размножения ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Высокая зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивирования в ферментерах, а тэкже может служить причиной их недостаточной стабильности.

Цель настоящего изобретения состояла в получении гибридомного штамма. который;

1) не требует для размножения ростовых факторов эмбриональной cblBopoTKI

2) синтезирует МКАТ. пригодные для определения концентрации IgE в сыворотке крови человека, Достижение поставленной цели было обеспечено:

1) использованием при получении гибридом клеток миеломного штамма 653.А (ВСКК (П) и 7 D, а.с. ¹ 1381982), размножение которого не требует ростовых факторов эмбриональной сыворотки;

2) отбором среди полученных гибридом штамма Е/5D4, синтезирующего МКАТ, которые сохраняют антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе и при присоединении ферментной метки, Описываемый штамм Е/5D4 подобно

ПРОТОТИПУ синтезирует МКАТ, специфичные к константной области IgE человека и способные в адсорбированном на твердой фазе состоянии извлекать IgE из раствора.

В отличие от ПРОТОТИПА штамм

Е/5D4 получен на основе миеломной клеточной линии 653.А и не требует для размножения ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтезируемые штаммом

Е/5D4 МКАТ обладают свойством, наличие которого у прототипа неизвестно: в виде конъюгата с ферментом они позхволяют определять общее содержание Ig Е с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста. Кроме перечисленного, штамм отличается от ПРОТОТИПА генотипом животных-доноров иммунных лимфоцитов (мыши линии ЯЛ /J), Совокупность описанных свойств позволяет рассматривать предлагаемый гибридомный штамм РИ-8-Е/5D4, как объект, обладающий существенными отличиями от п рототи па.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 403Д.

Справка о депонировании прилагается.

Штамму присвоено авторское наименование РИ-8-Е/5Д4;

Получение гибридомного штамма.

Донорами иммунных лимфоцитов служили сыши-масцы линии ЫL/J, которых иммунизировали дважды с интервалом в 1 неделю подкожно препаратом миеломного

IgE/I (40 мкг) в полном адъюванте Фрейнда, на 11 и 12 дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 мкг IgE в физиологическом растворе, Спленоциты для слияния получали через 24 часа после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр анти-IgE-антител превышал

1:20000. Партнерами для гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А, выращенные на питательной среде, 1776691

20

50 содержащей модифицированную Дюльбекко среду Игла (90%) и сыворотку крупного рогатого скота (10%). Для слияния использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн клеток миеломы. Смесь клеток обрабатывали раствором полиэтиленгликоля (50%) с молекулярной массой 1000. Для выращивания гибридов использовали питающий слой из перитонеальных макрофагов мышей и питательную среду указанного выше состава, содержащую в 100 мл (мкг): аминоптерин-10, гипоксантин-500 и тимидин 500.

Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11 по 28 дни после слияния. Выявление МКАТ, специфичных к константной области эпсилонцепи вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа аналогично известному способу (3, 5), используя в качестве антигенов миеломные Ig E, препараты

IgG, IgM, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и лямбда-типов (табл.

2), Из 480 первичных культур 12 синтезировали антитела, связывающие с IgE/L-иммуногеном, Среди них одна культура продуцировала антитела. направленные к легкой цепи каппа-типа.

Продукты синтеза 5 культур связывалисьc IgE/L-иммуногеном, но нереагировали с миеломным 19Е/Ю. Наконец, 6 культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с!цЕ/L, так и с 1цЕ/Ю. Эти 6 культур, обозначенные как семейство гибридом

РИ-8, были подвергнуты дальнейшему изучению.

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей. Клоны, которые при двух последовательных клонированиях с плотностью посева, равной 1 клетке на I или 2 лунки, давали более 95% субклонов, синтезирующих анти-igE-антитела, переводили в массовую культуру. Выращенные в культуре клетки внутрибрюшинно прививали гистосовместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым эа 7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по

0,5 мл).

От мышей с растущими опухолями на

14-21 дни получали асцитические жидкости, MKA из асцитов адсорбировэли нэ твердой фазе и исследовали их способность связывать lgE из раствора. Заменяя растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, выявляли МКАТ, которые связывают поликлональный сывороточный IgE, т.е. специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. Были отобраны 5 клонов-продуцентов МКАТ, удовлетворяющих критериям селекции.

МКАТ, специфичные к константным эпитопам IgE, исследовали на способность сохранять иммунологическую активность при присоединении ферментной метки, Для этого МКАТ из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония (6) и методом периодатного окисления к ним присоединяли фермент — пероксидазу хрена (7), Иммунологическую активность полученных конъюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, эдсорбируя на твердой фазе ми ел о ми ы и I g E. Продукты пяти клонов после присоединения ферментной метки сохраняли антиген-связывающую активность, Подбор MKAT для двухдетерминатного иммунометрического теста определения

1gE проводили, испытывая поочередно адсорбированные нэ твердой фазе МКАТ в сочетании с мечеными пероксидазой МКАТ в качестве выявляющих реагентов (табл. 3).

Найдено несколько сочетаний иммабилизованных и меченых МКАТ, позволяющих определять IgE в сыворотке крови.

Оптимальный результат был получен при иммобилизации на твердой фазе MKAT клона 5Д4 и выявлении фиксированного 1цЕ с помощью меченых пероксидазой MKAT клона 4Ф4. Удовлетворительный результат был получен также при использовании конъюгата, приготовленного на основе MKAT

Е/5Д4.

Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/5Д4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т.е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки, и продуцировать МКАТ, пригодные для двухдетерминантного иммунометрического метода определения содержания IgE в качестве меченого реагентэ или в качестве иммобилизованного антитела, извлекающего!цЕ из раствора.

Ха ра кте ри сти ка ш та м ма.

Штамм Е/5Д4 принадлежит к семейству гибридом РИ-8.

1) С момента получения из родительских клеток штамм прошел 28 пассажей в культуре, включая 4 цикла клонирования методом лимитирующих разведений на питающем слое из макрофагов мышей.

2) Стандартными условиями культивирования являются следующие: питательная среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Клетки выращивают при+37"С в герметично закрытых флаконах или в открытой

1776691

10 системе — в планшетах. чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7.5% углекислоты в воздухе при 100% влажности.

3) Оптимальная посевная доза составляет 200 тыс клеток в 1 мл среды, Для поддержания клеток в пролиферирующем состоянии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:4 — 1;5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохраняют способность к пролиферации при снижении содержания сыворотки да

2,5%, при этом кратность рассева составляет 1;2. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,2-1,4 млн клеток в 1 мл.

4) Культура описываемого штамма представляет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаются агрегаты из 4-х или более клеток, которые легко суспендируются пипетированием.

5) Культура штамма Е/5Д4, постоянно выращиваемая без антибиотиков, не содержит бактерий. грибов, дрожжей и микоплазмы, 6) Клетки штамма перевивают в виде асцитических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гистосовместимых мышах-гибридах

F1(SJ L/J x BALB/c). При внутрибрюшин ной прививке 5 млн клеток животным в возрасте

1,5-3 месяца, предобработанным за 7-18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развивается в течение

14-21 дня. От одной мыши получают при первой пункции 4-10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 7-2б мл асцита.

7) Маркерные признаки штамма: а) штамм синтезирует MKAT против IgE человека. Антитела выявляются в культуральной жидкости при поддержании клеток

irl vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным; б} штамм обладает онкогенностью, Которая выражается в росте солидных или асцитических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов F1(SJL/JxBALB/c) при прививке им клеток гибридом.

8) Характеристика MKAT. продуцируемых штаммом гибридомы Е/5Д4. Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса . IgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон-цепи Ig E человека. Специфичность MKAT может быть проверена в твердофазном иммуноферментном анализе с помощью Ig E. адсорбированного на твердой фазе. МКАТ связываются с белком А стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твер20

55 дой фазе МКАТ способны связывать сывороточный IgE и могут использоваться в качестве захватывающих антител в системе двухдетерминантного иммуноанализа (в паре с мечеными lgE-специфичными антителами) или при афинном извлечении IgE иэ сывороточных препаратов. MKAT Е/5Д4, сохраняя антиген-распознающие свойства после присоединения ферментной метки, могут также служить выявляющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанализе.

Антитела специфичны в отношении эпитопа на IgE, который не экспрессируется при образовании комплекса Ig Е с антигеном (аллергеном), и не могут использоваться для выявления фракции специфического IgE в аллергосорбентном тесте.

9) Продуцируемый штаммом иммуноглобулин выявляется в культуральной среде при культивировании клеток, Обратный титр МКАТ в переросших культурах при выращивании клеток в стандартных условиях составляет 1000-21000. Такой же титр может быть получен при снижении содержания сыворотки в ростовой среде с 10% до 1,2%, При росте гибридомных клеток в мышах обратный титр МКАТ в асцитической жидкости составляет 100000-600000. Среднее содержание иммуноглобулина в асците составляет 8 мг/мл.

10) Стабильность продукции МКАТ оценивали при пассировании клеток на мышах в течение 7 пассажей, За этот период клетки сохраняли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровня МКАТ прослежено в течение 24 пассажей.

11) Условия криоконсервации. Криосреда состоит иэ 45% среды Игла. 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие

1-10 млн клеток в криосреде помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70С в течение суток. затем хранят при -70С или переносят в жидкий азот. Для размора>кивания клеток ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 минуты погружают в воду с температурой +48 С.

Затем центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и рассевают в платы при концентрации 500 тыс клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 60-70% по данным пробы с 0.5% трипановым синим. Через 1 сутки клетки повторно рассевают с концентрацией 200 тыс клеток в 1 мл ростовой среды.

1776691

МКАТ Е/5Д4.

Примеры получения и использования

МКАТ, синтезируемых штаммом Е/5Д4. 40

50

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ПРЕДЛАГАЕМОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Схема 1. Выявление IgE с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста

Схема 2, Выявление аллерген-специфического Ig Е с помощью аллерго-сорбентноготеста

Таблица 1. Гибридомные штаммы-продуценты МКАТ против IgE человека.

Таблица 2. Результат тестирования специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом.

Таблица 3. Выявление IgE с помощью двухдетерминантного твердофэзного иммуноферментного анализа.

Таблица 4, Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки.

Таблица 5, Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/5Д4, в культуральной среде и в асцитической жидкости.

Таблица 6. Содер>кание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

Таблица 7, Выявление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноаналиэе с помощью меченых МКАТ Е/5Д4.

Фиг. 1. Калибровочная кривая для определения содержания IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

Фиг, 2. Калиибровочная кривая для определения содер>кания IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммунометрическом тесте с помощью меченых

1, Выращивание культуры гибридомы для последующей поививки мышам.

Посевным материалом служат гибридомные клетки, хранящиеся в жидком азоте.

Для размораживания пробирку, содержащую 5 млн клеток, извлекают иэ сосуда с жидким азотом, погружают на 3 минуты в воду с температурой +40 С, после полного оттаивания пробирку центрифугируют 3 минуты при 1000 об/мин, удаляют надосадок, клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированная Дюльбекко среда Игла-90%. сыворотка крупного рогатого скота-10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой +37 С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе, Через сутки проводят визуальный контроль состояния клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флакона

20 прибавляют 15 мл ростовой среды. На 4 сутки после размораживания клетки пересевают в разведении 1;5 и переносят во флакон объемом 250 мл. Через 2 суток берут пробу для подсчета клеток — в 1 мл суспензии содержится 800 тыс гибридомных клеток. Суммарное содержание клеток в культуре 100 млн, что составляет 20 прививочных доэ. Клетки осаждают центрифугирова нием (1000 об/мин, 20 мин), суспензируют в среде Хенксэ и вводят по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышаммежлинейным гибридам F1(SJL/JxВЛ В/с), получйвшим за 11 дней до прививки внутрибрюшинную инъекцию пристана.

11. Получение гибридомных асцитических жидкостей и выделение из них глобулиновой фракции, содержащей МКАТ, Накопление асцита в брюшной полости мышей начинается на 11-й день после прививки клеток гибридомы. На 14-й день проводят первую пункцию. При этом получают от каждых 10 мышей 45-50 мл асцита, На 17 день повторно пунктируют оставшихся s живых мышей и получают еще 40-45 мл асцита. К 20-му дню остается около 50% привитых сышей. В результате третьей пункции получают 10-15 мл асцита. Общее количество асцита, получаемое от 10 мышей, составляет 105-110 мл.

После образования фибринового сгустка и отделения его от клеточной массы с помощью центрифугирования из 110 мл асцита получают 100 мл надосадочной жидкости, из которой выделяют глобулиновую фракцию. Для этого к жидкости приливают по каплям в условиях непрерывного перемешивания равный объем насыщенного раствора сульфата аммония с рН-7,0. Осадок отделяют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок растворяют в дистиллированной во де, доводя объем раствора до исходного, Процедуру высаливания повторя1от, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммония и в таком виде хранят при +4С, !

И. Получение содержащих МКАТ культуральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки, Источником клеток служит гибридомный штамм, хранящийся в жидком азоте.

Клетки размораживают и высевают как описано в примере 1, Через сутки vîí Tðàëèðów>T состояние клеток с помощью инвертирпванного микроскопа и определяют их содержание в культуре с помощью камеры Горяева.

Суспензия содержит 400 тыс клеток в 1 мл, При первом пересеве к 10 мл культуры до1776691

5

30

55 бавляют 10 мл ростовой среды, содержащей

10 сыворотки, Через 1 сутки культуру разделяют на 2 части: первую оставляют без пересевов до перероста для определения титра МКАТ, Ко второй прибавляют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентрация сыворотки снижается до 5 ь. Через 2 суток взвесь клеток, выросших на среде с 5 сыворотки, разделяют на 3 части. Первую оставляют без рассева до перероста для определения титра МКАТ. Вторую часть четырехкратно пересевают на среде с

5 сыворотки (каждые 3 дня с коэффициентом 1:4) и затем оставляют до перероста для определения титра МКАТ. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 1,5 . На 3 сутки культуру разделяют на 2 части: первую оставляют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1.25 и спустя б дней из нее берут пробу для определения титра МКАТ. Данные определения титров МКАТ на всех стадиях процесса приведены в таблице 4.

К. Определение титра мышиных антител против Ig E человека.

Источником мышиных антител против

Ig E служат: а) сыворотка крови мышей, иммунизированных igE человека, б) культуральная жидкость от растущих гибридомных клеток, в) асцитическая жидкость мышей с растущими гибридомными опухолями, г) глобулиновая фракция содержащих MKAT асцитических жидкостей.

Титр антител против Ig E человека определяют с помощью твердофаэного иммуноферментного анализа. Реакцию проводят в

4 этапа. На всех этапах для промывания и разбавления реагентов используют раствор, содержащий 0,85 хлористого натрия, 0,01 М фосфэтного буфера с рН 7,4 и

0,05 таина-20, На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Для этого в ячейки планшетов для иммуноанализэ вносят по

100 MK/l раствора, содержащего 10 мкг

19Е/L в 1 мл карбонат-бикарбонатного буфера (0,01 М, рН-9,5). Инкубируют не менее

10 часов при +4С. Удаляют антиген иэ ячеек и однократно промывают.

На втором этапе в лунках планшетов готовят серийные разведения исследуемых образцов объем по 100 мкл, инкубируют 1 час при+37 С, лунки освобождают от проб и трижды промывают, На третьем этапе к связанным на твердой фазе мышиным антителам присоединяют меченые пероксидазой кроличьи антитела против иммуноглобулинов мышей.

В лунки вносят по 100 мкл рабочего разведения коньюгэта, инкубируют 45 мин при

+37 С, удаляют коньюгат и 5-кратно промывают.

На последнем этапе с помощью цветной реакции выявляют активность пероксидазы, связавшейся с твердой фазой. В лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (1 мг орто-фенилендиамина и 2 мкл 33 перекиси водорода в 10 мл 0,05 М цитратного буфера с рН-4,7), инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 50 мкл 2Н серной кислоты, Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре

"Мультискан-MC" при длине волны 492 нм.

Результаты представлены в таблице 5.

V, Использование иммобилизованных на твердой фазе МКАТ Е/5Д4 для количественного определения содержания IgE в сыворотке крови человека

Концентрацию lgE в сыворотке крови определяют с помощью двухдетерминантного твердофазного иммуноанализа, Адсорбированные на твердой фазе MKAT 8У/5Д4 служат для захвата антигена из образца.

Для выявления ig E. включенного на твердой фазе в иммунный комплекс, используют меченые ферментом специфичные к igE поликлональные антитела, изготовляемые НПО

"АЛЛ Е РГЕ Н" (г, Став ропол ь), или моноклональные антитела, например, МКАТ продуцируемые клоном РИ-8-Е/4Ф4." Реакцию проводят в полистироловых планшетах фирмы NUNC, Для разбавления реагентов и отмывания планшетов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета вносят раствор МКАТ Е/5Д4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера. рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С. раствор удаляют и лунки однократно промывают.

На втором этапе в лунки вносят образцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные для построения калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют при +37 С 1 час, образцы удаляют и лунки трехкратно промывают.

На третьем этапе в лунки вносят рабочее разведение коньюгатэ, инкубируют 1 час при +37 С, раствор удаляют, планшет промывают пятикратно.

На четвертом этапе в лунки вносят субстратную смесь для выявления активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре. реакцию останав13

1776691

14 ливают серной кислотой и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру И). На основании полученных данных строят калибровочную кривую.

По оси абсцисс откладывают концентрацию

IgE в ME/ìë, по оси ординат — оптическую плотность проб (фиг, 1). Пользуясь калибровочной кривой и учитывая коэффициент разведения исследуемых сывороток, определяют содержание в них IgE (таблица

6).

Vl. Использование МКАТ E/5Ä4 в качестве меченого реагента дпя количественного определения содержания IgE в сыворотке крови человека, Концентрацию IgE в сыворотке крови определяют с помощью двухсайтового варианта твердофазного иммуноанализа. Адсорбированные нэ твердой фазе

Ig Е-специфические антитела служат для захвата антигена из образца, Для выявления

IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс используют меченые пероксидазой МКАТ 8Е/5Д4. Реакцию проводят в полистироловых планшетах фирмы NUNC.

Для разбавления реагентов и отмывания планшетов от несвязавшихся компонентов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета вносят раствор MKAT 8Е/4Ф4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН-9,5, Инкубируют в течение ночи при +4С, затем раствор удаляют и лунки однократно промывают.

На втором этапе разведения исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные для построения калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia) вносят в лунки планшетов, инкубируют при +37 С 1 час, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно, На третьем этапе рабочее разведение конъюгата МКАТ 8Е/5Д4 с пероксидазой вносят в лунки, инкубируют 1 час при+37С, раствор удаляют, планшет промывают 5 раз.

На четвертом этапе в лунки вносят субстратную смесь для выявления активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере К, Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, затем останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На

55 основании полученных данных строят калибровочную кривую, По оси абсцисс (логарифмическая шкала) откладывают концентрацию!оЕ в МЕ/мл, а по оси ординат — оптическую плотность соответствующих проб (фиг, 2). Пользуясь калибровочной кривой и учитывая коэффициент разведения исследуемых сывороток, определяют содержание в них Ig E (таблица 7).

Технико-экономическая эффективность изобретения.

Преимущество предлагаемого гибридомного штамма РИ-8-Е/5Д4 определяется тем, что для поддержания его в культуре не требуются ростовые факторы эмбриональной сыворотки. Поскольку применяемая в работе с полученным штаммом сыворотка крупного рогатого скота в 50-100 раз дешевле эмбриональной сыворотки, затраты при наработке МКАТ в условиях культивирования и при наращивании клеточной массы для прививки животным существенно снижаются.

Преимущества МКАТ, продуцируемых предложенным штаммом, в сравнении с поликлональными антителами состоят, вопервых, .в том, что для получения каждой новой партии антител не требуется повторения цикла иммунизации и расхода очищенного IgE человека,. который из-за редкой встречаемости больных с IgE-продуцирующей миеловой черезвычайно малодоступен, Во-вторых, иммунохимические тесты, основанные на применении МКАТ против IgE, обладают абсолютной специфичностью, тогда как специфичность поликлональных сывороток может варьировать в широких пределах.

К преимуществам описываемого штамма относится то, что синтеэируемые им

МКАТ, иммобилизованные на твердой фазе, могут в сочетании с мечеными IgE-специфичными моно- или поликлональными антителами обеспечивать определение общего

IgE в сыворотке крови человека. МКАТ, продуцируемые штаммом, сохраняют антигенраспознающую способность при присоединении ферментной метки и могут также служить выявляющим реагентом при определении IgE методом двухдетерминантного твердофазного иммуноанализа.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1 . ВСКК (П) N.

403Д вЂ” продуцент моноклональных антител против Ig Е человека.

1776691

ГибрГДОмные штсиВЯ нр0ДУЦентц МКеЛ прОтиВ I gK ЛОВекз

ИСТОВ ПИЬММОВ уцентон ИЩИ,..:.

Вртнеры и слиянии ОблВстъ приьВнениЯ

ЯИО 4Ео щ юлц

Balb/ñ

2. НК2/1

БЕЗ/3

ЧЯ4/3

РЗхбЗ Ва1Ь/с

А Я. 683

4 IgE/" 1-1 Зх653 Ва1Ь с

ПОл кОличВстВенный ОдНОСТ) Ï8Í×ßÅÛÉ ДВУХСЬЙтОВый иьйя(НОферментный 2 тест иыявлвны Обшрго

IgE

ТВердоФВзнцй аллергосар° б&НТНЫР РВДГОИММ1ЯОЬНВля для Выязления зллерГенспеЦифичесиОГ0 IQE

Раличестаанное определеHHB 06П@ГО IgE З рВДИО- 4 или иммунОф8рментнОм ьньЛИ38 .СпреДВление 0ЙЦВГО IgE с п0мОЩьВ ДВ хсййт020 б

70 И4М НОфе йИнтБОГО

ВНРЛИВВ

1776691

Таблица 2

Результат тестирования специфичности антител, праду рруемых первичными культурами гибридом.

Обозначения гибридом

1С1 1Е10 504 589 4F1 4F2 4F4 4F12 4СЯ 1С4 5СЗ SC1

Тестзнтигены

Миеломный IgE/I.

Ииеламный IgK/IO

Ig8

IgM

Каппа-цепи

Лямбда-цепи

Примечания: + антитела связывавтся с антигеном отсутствие реакции меящу антителами и антигеном

Таблица 3

Ветвление 1gE с GGMD E двухдетерминантного твердафазного жмуноферментного анализа.

Сптичес azoTHocm ape sammy

IgE ионь@гатами МКАТ с пероисидааой

5Д4 1Е10 411 46й2 4С4

О, 124

0,176

О, 05

О, 2.60

0,634

Примечание. Определение tgE проводилось и пуле из 13 сывороток от аллергичесяих больных. Разведение

05разца 1: 10.

МИАТ на твердой фазе

5Д4

1Е10

461

4И2 ,дл

О, 005

0,120

О, 114

О, 271

О, 620

О, 123

О, 140

0,019

0,116

О, 123

0,568

0,481

0,139

0,145.

0,469

1,490

0; 551

0,337, О, 448

0,678

1?76691

Таблица 4

/, Титры МИАТ, продуцируемых клетками штамйа BE/5Ä4 ,при выращивании в низкасывороточной среде.

NN Содержание Номер пассажа сыворотки в среде данного Обратный титр МКАТ в среде (ХХ) состава

6.!

Примечание. В таблице представлены средние и предельные (s скобка ) 3HszeHna обратны титров, полученные для 6-9 отдельных культур.

Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/5Д4

В к льтуральной среде и В зсцитической жГдкости.

Яулътура ю volvo

Иультура ж ч1 го

NN Обратный титр пассатов MKA T

NN Обратный титр пассала . БЕАТ

Примечание. В таблице представлены средние показатели абратньж титров ERAT, полученные при анализе 4-6 обрагцов.

1.

2б

3.

4, 5.

5

2,5 . 2,5

1Ф2

3 200

12 200

18 ОСС

6 400

10 200

7 400

12 800

12 800 (3 200 — 25 600 )

6 400 (1 600 — 12 800 )

7 200 (1 600 — 12 800 )

10 200 (3 200 - 25 600 )

8 100 (3 200 - 12 800 )

7 200 (1 600 - 12 ЕОО ) 600 GOO

200 000

200 000

100 000

200 000 . 600 000

100 000

1776691

Таблица б

Содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухсайтовом 1ьвуноанализе с помощью иммобилизованных 1 КАТ Е/5д4.

Количество IgK

-ИЕ/мл

Оптическая плотность

NH образца

Примечание. Определение содержаньи IgE в сыворотке проведено с помощыа калибровочыой кривой, ФИГ. 1.

Таблица 7

Выявление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанзлизе с помощью меченых ИКАТ Е/6Д4.

БМ Обозначение Разведение Оптическая Иоличество IgE сыворотки сыворотки плотность ЫУмл

Примечание. Определение содержания IgE в МЕ/мл в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой, прадставленной на ФИГ. 2.

4

6

1. ДЛ

2. ЛЛ

3. Лис

4. Бор

5. HC

6. HI

7, ВК

8. BE

9. МС

10. MI

О, 955

О, 775

1, 190

0, 681

1, 166

0,600

О, 884

0,998

1: 100

1: 10

1: 100

1: 100

1: 100

1:10

1:10

1! 10

1:10

1:10

О, 131

0,090

0, 699

О, 609

О, 208

0, 138

0,762

1,410

0,069

О, 061

42

18

103

21

92

28

500

1300

1700

700

200

600

20

1776691

Схема 1. выявление IIIE c воющьп двухнетернкнвнтнаго паочвютрнческого тестя. и» сущность этапе аналяан

St8cR

Схенатнчесюе

НаооРНЛаННЕ

Инкубацнн с Нхвт-}1 против: Я } Я

IIIE, мчено 4е}пятом, неотопои ялк 4яуоротрою}ь . Д Д проянденне реакции - выяв- ление кеткн, 4якснрованной на 4аае.

}Фниечвнне(после калдого нэ укааанныт нтапов проивводятся Отмыввние От компонентов, яе сннааняяхся с твердой фенов

Схема 2, Выявление аллерген-специфичного IIIE с помощьв аллергосорбентнаго теста

Сущность атапа еиализз

Схематическое иаобрииение атапв

""- - :=:::":-:-. =";" JUUUL точных антител с аллергеном.

Примечание. После каждого из указанных атапов производится отмывание от компонентов. se свяааваихся с твердой фззой.

1. Ваюсяннввпня lEAT- Г нротян IIIK ня твердой 4яэе.;

Инкубацпн с ясследуенння обраацамн, содерквщнкн IgE.

Формирование яниунного комплекса "НЕАт- }/ Igh" на твердой 4вае.

1. Жаюбилиаация аллергена твердой фазе.

Иикубация с }RAT против. ICE, мечеными ферментом или изотопоы. Формирование иммун- ного комплекса MEAT и IgE, связанного с аллергеноа

4. Выявление ферментной иди изотопнай мотки, связанной на твердой фазе.

oî о о

:3

1776691

ОВ 4Ч2 и» в.е

5Е 188

5 1В

Фи . 1

»пвкы гибридных культяяярувыых клеток ькьоткых йа nascu1иа ( (SCuVП Но 4Оа3, яспольвув»аб» дла получвнни ыояоклональных витктвл . против иьмуяоглобулина и чвлоявка

Ось абсцисс концвитрацкя 1ЯЕ В IE/ìa, опь ординат - о тичвсчкаи плотность при д»инв яоляы 492 ны.

0D/И иа в ав,, ss агав

»йаьаг гибридных яультквярувки клвток ювотных йв wscuIus (, (KHJvIv Йо 4 ), нсбольвув»ай дли получвнин ыонокаональяа аятитвл против иыкуяоглобулина и чвлоявка

Ось абсцисс - концвнтрацян 4пб я Ый ыл, ось ординат - оптичвсчкая плотность прк длюв вола 402 Iol

Составитель Г.борискина

Техред М.Моргентал . Корректор М.Максимишинец

Редактор

Производственно-издательский комбинат Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4101 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/б