Штамм гибридных культивируемых клеток mus.мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к кислотостабильному ингибитору трипсина из мочи человека

 

4 ф,-». фФ ф !@„СОЮЗ СОВЕТСКИХ

В=. Чф<Ф, 1 СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ вЂ” РЕСПУБЛИК (sI)s С 12 У 5/00, С 12 P 21/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СРИДЕТЕЛЬСТВУ (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК KJS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К КИСЛОТОСТАБИЛЬНОМУ ИНГИБИТОРУ ТРИПСИНА ИЗ МОЧИ ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и может быть использовано в медицине и биологии для тестирования кислотостабипьного ингибитора трипсина из мочи человека (МТИ) в биологических жидкостях.

В научной и патентной литературе описаны только поликлональные антите ла к МТИ. Такие поликлональные антитела обладают высокой аффинностbIO, однако каждая новая партия сыворотки в определенной степени будет отличаться от предыдущей из-за индивидуальных особенностей между подопытными животными, используемыми для получения сыворотки.

Цель предложенного технического решения заключается в получении гибГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) . (2l ) 4879754/13 (22)02.11.90 (46) 30.11.92. Бюл. 1" 44 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Беккерт Ральф (ФРГ), Бауер Ма рио (ФР Г), П. Г. Оглобли на, Л.А. Белова и М.Д.Смирнов (56) Nishina А., Aoki К., Tokura Y.

et аl. Haemostasis 1989, v. 19, р. 112- l l9.

5U 1778183 А1 медициНская диагностика опухолевых заболеваний, септических состояний и болезней почек. Сущность изобретения: получение гибридного штамма клеток

Иыв musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к трипсинсвязывающему домену кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c c клетками мышиной миеломы Р301. Секреция МКЛ на 3-4 день культивирования

in vitro составляет 10-25 мкг/мл, в асцитной жидкости — 5-10 мг/мл. МКА относятся к Ig61. Стабильная продукция антител сохраняется как минимум до 40 пассажей in vitro u in vivo. табл. ридного штамма, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к трипсинсвязывающему домену кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека. Штамм получают следующим образом. В качестве антигена используют препарат МТИ, полученный из мочи больных нефритами сорбцией белков на анионообменнике с последующей очисткой аффинной хроматографией на химотрипсин-сефарозе без предварительного разделения МТИ на молекулярные формы. Мышей линии BALB/ñ иммунизируют внутрибрюшинным введением .

100 MKI препарата антигена в 0,1 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами (ЗФР) (1О нМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,4, 150 мМ

ИаС1), в полном адъюванте фрейнда

1778183 (200 мкл). Иммунизацию повторяют «ерез 7 и 14 дней, вводя,внутрибрюшинно по 100 мкг того ие препарата в

100 мкл ЗФР с неполным адъювантом (рейнда (200 мкл) . На 21, 22 и 23 дни после первой иммунизации мышам апплицируют по 100 мкг антигена в ЗФР

7 внутрибрюшинно. На 9 «10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизуют с 3«10 клеток миеломы мыши

Р>О< с помощью 0,8 мл 501-ного раст.вора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 3350 (на среде Dalai, рН 8, О), в течение 1 мин. После гибридизации и отмывания клеток от ПЭГа, клетки высевают в 96-луночные панели по 2>

«10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPHI-1640 с добавлением 203 телячьей эмбриональной сыворотки, 10 И гипоксантина, 4t 10 И аминоптерина и 1,6 10 И тимидина. Гибри" ды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по Я5

0,1 и 1 клетке в лунку, содержащую

4«10 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100 ь субклонов продуцируют антитела к ИТИ.

Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают N2.

Штамм М2 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 2.10.90 под номером BCI(K/Ï/505 Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральныепризн а к и. Штамм выращивают в пластиковой посуде. Посевная доза 50-100 тыс. клеток в мл. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:3.

Культура суспензионная, в микрообъемах может вь|ращиваться как монослойная. Стандартные условия культивиро.вания: cpepa RPNI-1640 с бикарбонатом и 203 телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мИ L-глутамина, l00 мкг/мл стрептомицина, 100 ИЕ/мл пенициллина при 37 С в атмосфере 53 углекислого газа. Культивирование в организме жи- 50 вотных: интактHblM t ttU Jt H BALB/ñ за 10 дней до инъекции штамма ввводят по 0,5 мл пристана в/бр. Штамм инъекцировали внутрибрюшинно по 1-5: 10 клеток в 1 мл среды Игла. Образование асцита — через 12-16 дней.

Возможна по крайней мере двухкратная перевивка штамма.

Характеристика целевого продукта.

Штамм продуцирует моноклональные антитела - иммуноглобулины класса IgG1.

Эти антитела специфически реагируют с трипсинсвязывающим доменом кислотостабильного ингибитора из мочи человека.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4 день культивирования зависит от посевной дозы t варьирует в диапазоне от 10 до 25 мкг/мл культуральной среды и от

5 до 10 мг/мл асцитической жидкости.

Стабильная продукция антител сохраняется как минимум до 40 пассажей in

vitro и при культивировании клеток в мышах в виде асцитной опухоли.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культу-.. ральной среды.

Криоконсервирование. Клетки штамма консервируют по 1х106 клеток/мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10 диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в программном замораживателе по следующей программе: температуру снижают до 4 С в минуту до о

4 С и по 1 в минуту до -40 С. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37 С. )(изнеспособност ь после разо мораиивания — по включению трипанового синего 70/.

Очистка целевого продукта. 71ля получения препарата ИКА в количестве, необходимом для проведения иммунохимических исследований, асцитную жидкость освобождают от клеточных элементов центрифугированием и добавляют сульфат натрия до конечной концентрации 18 ;. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,02 М ИаН РО„ рН 8,0 и диализуют против этого же буфера. После диализа.раствор наносят на колонку 16 200 мм с DEAE-Toyopearl б50И, уравновешенную тем ие буфером.

Антитела элюируют линейным градиентом NaH PO, рН 8,0 10-160 мИ. Иммуноглобулины класса IgG1 элюируют в интервале 60-80 мИ, чистота препарата по данныл электрофореза в полиакриламидном геле составляет не менее 95 0.

П ;. и f р 1. E3 J ."нках пог)и.<1113р в и н и Г1» 1) (01 ) 6 - Гl у f s ) I H p I I 1 rI !! B J l и д Г)Р и и к— р(1 «Tp ) ff ) ни я алсорб«п"!0T а HTI11 Рн

1 мк1. на луг(ку в 100 мкл карбон;)тно5 бикар()онаT ногo бv(i)Bра (0,02 М, рН 9,6, 0 буфер C) при Jl С B течение ночи. Для определения неспец«ф«ческого связыван»я B контрольные лунки вносят плазму крови человека в разведени«1: 1000 (100 мкл на лунку) в буфере С. После этого в лунках панели для блокирования свободных мест (:BBBIIBàíèÿ в тече1(ие 1 ч инкубируют 200 мкл 0,.0.)3-ного ра ст вора Т()ееп-20 в ЗФР (буфер Б) .

После удаления буфера в лунки вносят по 50 мкл последовательных двукратHfI)(разведений антител М2 с концентра ией от 2700 до 0,325 нг в 1 мл буфера Б и инкубируют 1 ч при комнат- 20 ной температуре. После этого панель отмывают три раза направленной струей водопроводной .воды и для проявления связавшихся в лунках MKA вносят в ячейки по 100 мкл раствора коньюгата 25 пероксидазы хрена с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, разведенного в 1000 раз буфером Б, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного отмывания водой для определения связавшейся в лунках пероксидазы в лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (100 мкл раствора о-фенилдиамина

1 мг/мл в 10 мл 0,02 М растворе цитрата натрия, рН 4,5, с 10 мкл 303ного раствора Н)0)) и инкубируют при комнатной температуре до развития коричневой окраски в ячейках. Оптическую плотность раствора при длине волны 492 нм определяют с помощью автоматического микроспектрофотометра.

Неспецифическое связывание при использовании плазмы крови человека отсутствует полностью, что свидетельствует о специФичности МКА к МТИ. При этом выявляется пинейный участок концентрационной зависимости связывания

MKA в интервале от 21 до 168,7 нг на

1 мл с антигеном, адсорбированным на пластиковой подложке. Кроме этого, по точке перегиба кривой можно определить, что константа связывания МКА с антигеном составляет не менее

42,2 нг/мл (0,26 нМ). Таким образом, полученные MKA не только высокоспеци- 55 фичны по отношению к МТИ, но и высокоан)инны, и поэтому могут быть использованы для р,::.эработки иммуноферментного метод", оп„:еделения МТИ.

1 б

П р 11 м B p 2. (1JIP о) .

0 лунках панели адсорбируют МТИ и блокируют свободные места связывания как в примере 1. Затем в лунках осуществляют двукратные последовательные разведения ИТИ от 20 до

0,078 мкг/f(J) в 50 мкл буфера Б .и в каждую лунку вносят по 50 мкл раствора МКА, 80 нг/мл. Перемешивают и инкубируют i ч при комнатной температуре. Дальнейшую обработку лунок панели проводят как в примере i: лунки отмывают водопроводнсй водой, инкубируют с разведением 1:1000 конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, отмывают водой и связавшуюся в лунках пероксидазу выявляют с помоцью субстратной смеси. Конкурируя с антигеном, адсорбированнь(м на твердой фазе, за связывание с МКА, жидкофазный антиген снижает количество антител, остающиеся в конечном итоге связанными с твер дой фазой. Таким образом показывают, что полученные МКА связываются с МТИ как адсорбированным на твердой фазе, так и в растворе. Это свойство мон(но использовать для создания конкурентного иммуноферментного метода определения МТИ в биологических жидкостях.

Пример 3. Препарат трипсинсвязывающего домена МТИ получают инкубацией раствора МТИ с трипс«ном в течение 8 ч при 37 С. МТИ и его фрагменты экстрагируют из реакционной

< м. си 3 ;-нын раствором НС I I.. !. и вйд<.= ппн>т хр;>и» г< рафией на тоипсин-сефароз< . Ра.цк.ление различных моле куля рных <>> рн t,ТИ и его фрагментов проао5

p l T г! Jlb3>>ëü Toëöèåé на сефадексе (:-100. К<>нцентрацию домена, мол. масса которого ни>не, чем у МТИ в 3,5 раза, принято выражать в ингибиторных единицах (IIL, 1 ИЕ = 11,5 мкг чистого домена). гак как это упрощает сопоставление данных по конкуренции до1 .мена в растворе и МТИ, адсорбированного на пластине, за связывание с

МКЛ. Для определения специфичности моноклональных антител МКА к детерми— нанте, расположенной на трипсинсвязывающем домене молекулы МТИ, используют метод конкуренции за участки связывания. Процедуру осуществляют как 20 в примере 2, но вместо двукратных разведений МТИ используют последовательные двукратные разведения домена от 0,09 до 6 ИЕ/мл буфе-ра Б. Постоянное количество HKA 25. (50 мкп, 00 нг/мл) добавляют к последовательным двукратным разведениям трипсинсвязывающего домена от

0,09 до 6 ИЕ. Конкурируя с МТИ, адсорбированным на твердой фазе, за связывание с МКЛ, домен снижает количество антител, остающихся в конечном . итоге связанными с твердой фазой. Таким образом показывают, что МКЛ специфически связываются с трипсинсвязывающим доменом молекулы >!ТИ.

Пример 4. Рлл установления возможности использования полученных

МКЛ в клинических анализах с целью определения концентрации 1!ТИ в моче че- <0 повека исследуют 20 здоровых доноров и 10 больных почечными симптоматичес-кими артериальными гипертониями (ПСЛГ) с достаточной и недостаточной

Функцией почек.

Мочу смешивают с двумя объемами холодногo ацетона, инкубируют 2 ч о при 0 С, центрифугируют 20 мин, 3000 об/мин. Осадок растворлют в ЗФР, объем которого равен половине объема взятой мочи. Иммуноферментное определение проводят как описано в примере

2, за исключением того, что вместо двукратных поспсдояательны резв д -.-, в лунки вносят лвукра нные ппс педовательные разведения (от 1/? до 1/64) полученного раствора аиетоновогo осадка белков мочи человека.

В качестве калибровочной кривой используют кривую, полученную в примере 2. Результаты исследований представлены в таблице.

Из данных таблицы следует, что определение 1!ТИ в моче больных IlCAI c помощью иммуноферментного анализа позволяет poñòoâåðío различить группы доноров и больных с достаточной и недостаточной функцией почек. Предло>ненный метод с использованием МКЛ перспективен, так как различил в концентрации МТИ в моче больных с достаточной и недостаточной функцией почек являются выраженными и колеблютсп от 4 до 10 раз. Полученные антитела позволят воспроизводимо определять МТИ в белковых осадках мочи в интервале концентраций 0,3-40 мкг/мл с помощью иммуноферментного анализа.

Таким образом, полученные МКА к трипсинсвязываюг-,ему домену МТИ можно использовать для onределения количества МТИ в биологических жидкостях человека и в частности в моче. Нет сомнений, что данное антитело может быть использовано и для реакции с ингибитором трипсина сыворотки крови человека, имеющим первичную структуру, аналогичную МТИ.

Птамм-продуцент получен на основе миеломной линии клеток мыши,, не синтезирующей собственных иммуноглобулинов и их отдельных цепей, что позволлет избежать возможных осложнений при очистке антител и гарантирует однородность конечного,,продукта. формула изобретения !!тамм гибридных культивируемых клеток >нивотных 1!ыя musculus J.. BCKK

/П/ Р 505 Л, используемый для получения моноклональных антител к кислотостабильному ингибитору трипсина из мочи человека.

1778183

Больные ПСАГ, ИТИ икг/мл ".îíîðû, ИТИ

1„ мкг/мл достаточная недостаточная функция по- функция почек чек

n=20, Ийт

n = 5

n = 5 среднее, И+и

7,96+ 0,51 54,54 9,0 3,8+0,8

Составит ель Л. Белова.

Реда ктор Jl. Павлова Техред И. Иоргентал Корректор Н. Слободяник

Заказ 4165 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета йо изобретениям и открытиям при .ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

6,9

6,7

6,9

7,8 I1,5

55,6

116,1

36,3

27,2

37,3