Способ определения областной трансформации лимфоцитов

 

Изобретение относится к клинической иммунологии. Цель - повышение точности и ускорение способа. Способ определения бластной трансформации осуществляют путем инкубации мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, в качестве которого используют культивируемую in vitro клеточную линию Raji, обработанную предварительно 0,8-1,2% раствором параформальдегида при соотношении клетки Raji: мононуклеарные клетки равном 0,8-1,2:1 и концентрации клеток 2-4-10 /м и инкубацию проводят в течение 48-50 часов. Предложенный способ определения РБТЛ сокращает время и увеличивает точность анализа. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК

ГО СУДА Р СТ В Е ННОЕ ПАТЕ-ПНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4881369/14 (22) 12.11,90 (46) 23,11.92. Бюл. N 43 (71) Институт иммунологии (72) M.З. Сидов, В.B. Кулаков, А.Д. Черноусов и Б.В. Пинегин (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЛАСТНОЙ

ТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (57) Изобретение относится к клинической иммунологии, Цель — повышение точности и ускорение способа. Способ определения бластной трансформации осуществляют пуИзобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике иммунопатологических состояний, сопровождающихся нарушением бласттрансформации лимфоцитов периферической крови.

Известен способ определения РБТЛ в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), Для этого готовили пул клеток-стимуляторов и пул отвечающих клеток. Клеточную (мононуклеарную) суспензию и в том, и в другом случаях получают стандартным способом седиментации разведенной гепаринизированной крови на градиенте Ficoll-Pogue (d =

=1,077 г/см ). После двукратного отмывания составляется клеточная суспензия в концентрации 1 10 /мл. Далее возможны два вари6 анта постановки реакции — сингенный и аллогенный. 8 случае сингенного варианта. в качестве клеток-стимуляторов используются аутологичные лимфоциты, в случае аллогенного варианта используются лимфоциты другого донора, либо смесь лимфоцитов, полученных от не» менее чем 10 различных доноров.

Для блокады пролиферативного ответа клеток-стимуляторов по всех вариантах ре„„. Ж„„1777085 A l (я)л 6 01 N 33/53, С 12 N 5/02 тем инкубации мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, в качестве которого используют культивируемую in vitro клеточную линию Raji, обработанную предварительно 0,8 — 1,27, раствором параформальдегида при соотношении клетки Raji: мононуклеарные клетки равном 0,8 — 1,2;1 и концентрации клеток 2-4 10 /м и инкуба6 цию проводят в течение 48-50 часов. Предложенный способ определения РБТЛ сокращает время и увеличивает точность анализа. 5 табл. акции их подвергают облучению в дозе

30 Гр, либо обрабатывают митомицином С в дозе 30-50 мкг/мл. После отмывания и ресуспендирования в полной питательной среде в вышеуказанной концентрации ставят непосредственно СКЛ. Результат учитывается по уровню включения Н-тимидина в опыте в контроле (1), Способ имеет следующие недостатки;

1. Ограниченная сфера применения способа, исчерпывающаяся в основном областью трансплантационной иммунологии.

2. Низкая точность способа, т.е. культивирование мононуклеаров на пластике без стимуляции в течение 1 дней индуцирует спонтанную бласт-трансформацию лимфоцитов и вследствие этого высокий уровень включения изотопа, )л

3. Длительность осуществления способа — 168 ч и необходимость создания условий для асептической работы.

4. Непригодность способа п ри и роведении иммуноэпидемиологических исследований.

5. Отсутствие стандартизации исполнения способа.

1777085

25

35

55

Наиболее близок к предлагаемому способ определения РБТЛ периферической крови человека, Способ заключается в следующем; периферическую гиперанизированную кровь разводят питательной средой (199 или PPMJ-1640), либо в сбалансированном солевом растворе (р-р Хенкса без Са

+2 и Mg+2, PBS) в соотношении 1:2 и наслаивают на плотностной градиент НсоИ-Pague (d = 1,077 г/см ).

После центрифугирования в режиме

250 g, 30 мин, 20 С собирают интерфазу, . дважды отмывают и ресуспендируют в полной питательной среде(ППС) известного состава; среда PPMJ-1640+10;, ЭТС + 2 мМ глютимина+ буфер ГЭПЭС 2 мМ+ гентамицин 80 мкгlмл с концентрацией клеток 2х х10 /мл. Суспензию мононуклеарных клеток в ППС раскапывают в лунки круглодонных планшет для иммунологических реакций, общий объем доводят до 0,2 мл. В лунках "Контроль" инкубируются чистые мононуклеары, в лунках "Опыт" инкубируются мононуклеары в смеси с митогенами — ФГА, Кон-А, МЛ в оптимальных митогенных концентрациях, подбираемых к каждой серии митогена индивидуально. Планшеты инкубируют в течение 72 «37 .С в присутствии 57-ной С02. Работа проводится в стерильных условиях. За 4 ч до окончания инкубирования в лунки планшет добавляют

Н-тимидин в дозе 1 мкк и в лунку, условия последующего инкубирования те же.

По окончании инкубирования содержимое лунок осаждается 12-канальным собирателем фракций — харвестером на стекловолоконные фильтры с диаметром пор 2,5мк,,Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах, обусловленный включением Н-тимидина в ядерные нуклеотидные последовательности трансформировавшихся лимфоцитов, просчитывается на счетчике

Р-излучения в толуольном сцинтиляторе (0,2 Г POPQP, 5 мг PPO на 1 л толуола), Результат реакции учитывается по трем параметрам: уровню включения изотопов в нестимулированные культуры (контроль), уровню включения изотопа в стимулированные мигогеном культуры (опыт) и индексу стимуляции (ИС), 1PP P/ (2) Способ имеет следующие недостатки:

1. Невысокая точность, так как использование искусственно полученных стимуляторов — митогенов дает мощный стимул к пролиферации и секреторной активности лимфоцитов, что в ситуации (и viva не наблюдается, Уже через 20-.30 мин после добавления митогена в мононуклеарную суспензию образуются огромные конгломераты клеток, хорошо наблюдаемые в инвертированном микроскопе, обусловленные агглютинирующим действием митогенов, И, как следствие, значительный разброс данных, достигающий несколько десятков тысяч имп/мин.

2. Длительный срок постановки реакции. С учетом получения окончательных результатов после 72 ч инкубирования — 96 ч.

3. Кроме того, получаемые результаты митоген-обусловленной пролифераций не всегда коррелируют с клиническим состоянием больного. В этом случае информативность способа сводится к минимуму.

4. Механизм РБТЛ на митогены сводится к специфическому взаимодействию ФГА, . либо Кон-А с соответствующими клеточны20 ми рецепторами и он не отражает той сферы межклеточных взаимодействий иммунокомпетентных клеток, которые обусловлены антигенами II класса гистосовместимости (HLA-DR, HLA DP ° HLA-DQ). Между тем последнее обстоятельство имеет существенно большее значение при оценке иммунного статуса, нежели первое, 5. Практическая неприемлемость способа при проведении иммуноэпидемиологических исследований, вследствие дороговизны способа, большой трудоемкости, полном отсутствии стандартизации и унификации его исполнения.

Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом, включающим в себя инкубирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, причем в качестве стимулятора используют культивируемую in vitro клеточную линию Ra)i, предварительно обработанную 0,8-1,2 раствором параформальдегида при соотно- шении клетки Ra)i: мононуклеарные клетки равном 0,8-1,2:1, концентрации клеток 2-4х х10 /мл и инкубацию проводят в течение

48 — 50 ч, Клеточная линия Ra)i обычно применяется для определения количества циркули50 .рующих иммунных комплексов с использованием радиоиммунологического метода (3).

Для тестирования РБТЛ на АГ клеток

Ra)I эта линия не использовалась.

Ниже приводится обоснование режимов способа.

Использование параформальдегида а диапазоне 0,8-1,2 обусловлено тем, что оптимальный эффект при обработке клеток параформальдегидом с сохранением анти1777085

В результате условия спонтанной РБТЛ становятся неоптимальными, что в свою очередь будет вносить существенную ошибку в конечный итог реакции.

Увеличение же концЕнтрации выше 4х х10 /мл сопровождается пропорциональным увеличением уровня включения Н-тиз мидина в контрольных лунках, что значительно изменяет результат реакции, вычисляемой по индексу стимуляции.

То же самое относится и ко времени инкубации — 48 — 50 ч: увеличивая это время, мы тем самым увеличиваем уровень включения изотопа в контроле, а уменьшение времени ниже 48 ч нежелательно, поскольку

55 генных мембранных детерминант и клеточной структурированности достигается именно в этом диапазоне. Снижение концентрации ниже 0,87 сопровождается существенной потерей фиксирующих свойств 5 параформальдегида, а увеличение этого процента выше 1,2 7ь нежелательно, поскольку не повышает фиксирующего эффекта параформальдегида на клеточные мембраны. 10

Обработка клеток Rajl параформальдегидом в диапазонных концентрациях блокируют их способность к пролиферации как в процессе культивирования, так и при действии стимуляторов. 15

Это обстоятельство имеет большое значение, поскольку позволяет учитывать пролиферацию только мононуклеаров исследуемых лиц в предлагаемом способе, Соотношением — клетки Rajl: мононук- 20 леарные клетки является диапазон 0.8—

1,2;1, Отклонения в ту или иную сторону по количеству клеток Raji является нежелательным, поскольку нарушает сложившийся оп. тимум бластогенного ответа мононуклеаров 25 периферической крови, Изменения указанного соотношения сопровождаются вариацией клеточной плотности на дне платика и, соответственно, изменением бласттрансформации и пролиферации мононуклеаров, 30 а также секреции ими цитокинов, что сказывается на точности предлагаемого способа, Использование в предлагаемом способе клеточной концентрации 2-4 10 /мл обус6 ловлено следующими обстоятельствами. 35

При постановке контролей, которыми сопровождается каждая реакция, раскапывание чистой мононуклеарной суспензии в объеме 100 мкл и с концентрацией ниже 2х х10 /мл не создает достаточной плотности 40 клеток в лунках плоскодонных пластин для иммунологических реакций и межклеточные контакты, таким образом, сводятся к минимуму. оно будет недостаточным для запуска всех процессов РБТЛ в клеточной культуре.

Конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. Периферическую гепаринизированную кровь в стерильных условиях разводят в соотношении 1:2 питательной средой 199 и наслаивают на градиент FicollPague (d = 1,077 г/см ). Центрифугируют в режиме 300 g в течение 30 мин при t =20 С).

По окончании центрифугирования собирают интерфазное кольцо, трижды отливают в среде 199 и составляют клеточную суспен-. зию в ППС известного. состава: среда .

RPMJ-1640+ 10 ЭТС+ 2 мм глютамина + буфер НЭПЭС 1 мл на 100 мл + гентамицин

80 мкг/мл в концентрации 2 10 /мл. Клетки

Raji (Catalogue of Cell Lihes, Hybridomas, 1985. АТСС, СС 86), культивируемые in vitro берут в реакции на 2-й день после пересева, когда они находятся в логарифмической фазе роста, отливают в ППС. составляют суспензию в концентрацией 2 10 /мл. Затем, 6 после центрифугирования и удаления надосадка, их помещают в 0,87, -ный раствор параформальдегида на PBS. Инкубируют

20 мин в холодильнике. По окончании инкубации трижды отмывают в PHS и ресуспендируют в ППС с тем, чтобы сохранилась упомянутая клеточная концентрация.

B лунки плоскодонных пластин для иммунологических. реакций раскапывают по

100 мкл мононуклеаров исследуемых лиц и клетки Raji в смеси (опыт, соотношение 1:1), а также чистые мононуклеары без клеток

Raji (контроль), Общий объем реакционной смеси составляет 200 мкл. Каждую реакцию проводят в трех параллельных лунках.

Плашки инкубируют при 37 С в присутствии

5%-ной COz в течение 48 ч. За 4 ч до окончания культивирования в лунки добавляют

0,5 мкКи Н-тимидина и затем содержимое з лунок осаждается на фильтры 12-канальным собирателем фракций. Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах фиксировали на счетчике/3-излучения (Mark-ill) в толуольном сцинтиляторе известного состава. Индекс стимуляции (ИС) просчитывали по формуле где и в числителе и,в знаменателе учитываются средние арифметические трех параллельных лунок для каждого измерения, В табл.1 приведены данные, полученные на 11 здоровых донорах.

Обсчет результатов проводили стандартными методами вариационной статистики.

1777085

Пример 2. Способ проводили анало- проведения реакции на 24 ч. Причем повы гично примеру 1 с той лишь разницей, что шение точности касается как абсолютного клетки Raji обрабатывали 1,2 -ным пара- включения Н-тимидина в опытных лунках, формэльдегидом, концентрация клеток со- так и вычисления индекса стимуляции. ставила 4 10 /мл, а инкубацию проводили 5 Ошибка опыта для первого и второго случа50 ч, ев в РБТЛ на антигены клеток Raji

Результаты представлены в табл.2. составляет, соответственно, 8,5 и 9,5, а в

Как видно из таблиц, результаты незна- РБТЛ на ФГА — 17,8 и 19,6%, Повышение чительно отличаются один от другого, что точностипредлагаемогоспособадостигаетпозволяет сделать вывод о практической их 10 ся также за счет следующих элементов реидентичности. акции.

Пример 3. Последовательность ма- Снижение времени инкубирования до нипуляции соответствует приведенной в 48 ч влечет за собой снижение уровня вклюпримере 1, при этом используют 0,8 /-ный чения изотопа в контрольных лунках (спонраствор параформальдегида, количество от- 15 танная бласттрансформация), этот уровень вечающих мононуклеарных клеток — 2х колеблется в пределах нескольких сот имх106/мл, время инкубации -48 ч, количество пульсов в мин, что в свою очередь уменьшаклеток Rajl 1,6 10 /мл, т.е. соотношение ет разброс этих данных и сни>кает ошибку

6, клетки Raji: мононуклеарные клетки состав- при вычислении индекса стимуляции. ляют 0,8:1, 20 Использование строго стандартизироРезультаты представлены в табл.3. ванной клеточной культуры позволяет в

П р и м P. р 4, Способ осуществлялся опытных лунках свести к минимуму разброс . аналогично приведенному в примере 1. данных, что также повышает точность споИспользуют1,2 / параформальдегида. соба, как при учете уровня абсолютного

Количество отвечающих клеток — моно- 25 включения изотопа в опыте, так и при вычиснуклеаров 2 10 /мл, время инкубации — лении индекса стимуляции. б

50ч, Все приведенные аргументы теряют

Количество клеток Rajl составило 2,4х свою силу при проведении РБТЛ на ФГА, х10 /мл, т.е. соотношение Rajl: мононукле- поскольку увеличение времени инкубирова. ары имеет вид 1,2;1, 30 ния до 72 часов пропорционально увеличиРезультаты представлены в табл.4. вает уровень включения изотопа в

Как видно иэ представленных таблицах спонтанной блэсттрансформации, а также в данных, результаты определения РБТЛ на опыте, когда клетки, получая мощный стиантигены клеток Raji варьируют в незначи- мул в виде ФГА, включают изотоп в десятки тельных пределах при использовании соот- 35 тысяч имп/мин, а это. в свою очередь, увеношения клеток Raji: мононуклеары от 0,8:1 личивая разбросданных, резкоснижаетточдо 1,2:1. Ошибка опыта колеблется от 8 до ность прототипа, как при учете абсолютного

8,5% по иС, что не вносит сущест1>енных уровня включения изотопа в опыте, так и изменений в .очность способа и таким об- привычислениииндексастимуляции(таблираэом является допустимой при практиче- 40 ца %5). ском использовании способа. Предлагаемый способ был апробирован

Для сравнения способа по прототипу с в экспедиционных условиях при:проведепредлагаемым для подтверждения большей нии иммуноэпидемиологических исследовэточностипоследнегоисокращения времени ний на металлургическом комбинате в проведения реакций были проведены па- 45 Нижнем Тагиле. Проведенная работа покараллельные эксперименты РБТЛ на анти- зала полную пригодность способа в экспегены клеток Яа)1 и ФГА в митогенной дозе диционных условиях, результаты

30 мкг/мл. тестирования РБТЛ на антигены клеток Rajl

Условия проведения реакций отражены 24 рабочих комбината дали индекс стимуляв примере 1 и прототипе. Результаты пред- 50 .ции: ИС = 8+0,74. ставлены в табл.5, Проведены также исследования по опВ таблица представлены средняя ариф- ределению возможности сохранения антиметическая iv ошибка средней арифмети- генных свойств клеток Rajl при длительном ческой m, а.также ошибка опыта Р = хранении. Для этого клетки извлекались из

rll 55 культуры, .обрабатывались 1 -ным параформальдегидом и оставлялись на хранение

КаК видно из приведенных данных. внемже при с:=4 С.Реэультатытестировапредлагаемый способ обладает большей ния РБТЛ на антигены клеток Raji, хранивточностью (в =реднем в 2 раза) по сравне- шихся 2 месяца в указанном режиме. ниюс прототипом. такжесокращэет время показали полное сохранение ими ан иген10

1777085

Таблица1

М вЂ” средняя арифметическая, (7 — стандартное отклонение, m — ошибк средней, P — ошибка опыта.

Таблица 2 ных свойств, индекс стимуляции при тестировании на 5 донорах составил 4 0,8. Этот факт открывает возможность. заготовки и длительного хранения стимуляторов при проведении иммуноэнидемиологических исследований.

Таким образом, предлагаемый способ определения РБТЛ на антигены клеток Raji обладает, по сравнению с прототипом, большей точностью (в 2 раза), сокращением времени проведения реакции на 24 ч.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет строго стандартизировать условия проведения реакции, поскольку длительно пассируемая 1и vitro культура Rajl обладает моноклональными свойствами, экспрессия мембранных АГ, на которые идет ответ, достигает стабильного уровня и обработка параформальдегидом фиксирует этот стабильный уровень:

Полученные данные по длительному хранению клеток Raji открывают возможность выпуска стандартизированных препаратов Raji, что. учитывая скудость советского рынка, является немаловажным фактором в обогащении методического арсенала учреждения иммунологического проФиля

Формула изобретения

Способ определения бластной трансформации лимфоцитов, включающий инкубирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, в качестве стимулятора используют клеточную линию Raji, обработанную предварительно 0,8 — 1,2 -ным раствором параформальдегида, при этом берут клетки Rajl è мононуклеарные клетки в соотношении 0,8-1,2:1 и концентрации клеток 2 — 4к

10 /мл, инкубацию проводят в течение 48 — 50 ч.

1777085

Продолжение табл. 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5 ехред M,Mîðãåíòàë Корректор Н. Ревская едактор

Заказ 4120 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101