Способ диагностики туберкулеза

 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к способам определения микобактерий туберкулеза. Целью изобретения является ускорение способа и повышение чувствительности диагностики. В среде для культивирования микобактерий после посева мокроты, методом непрямого иммуноферментного анализа в сроки 1-3 недели определяют антигены микобактерий туберкулеза с помощью моноклональных антител МГ-1 и антител из гипериммуных сывороток к микобактериям туберкуле за штамма H37RV, Для этого на полистироловые 96-луночные планшеты наносят моноклональные антитела, затем смыв с питательной среды, на которую была посеяна мокрота больного, затем антитела из гипериммунной сыворотки к микобактериям туберкулеза, реакцию проявляют антителами против глобулинов кролика, меченными пероксидазой хрена и истощенными на глобулинах мыши! После добавления ортофенилендиамина с перекисью водорода измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности на 0.2 единицы и больше по сравнению с контролем считают положительной реакцией. По сравнению с прототипом сокращаются сроки диагностики туберкулеза в среднем в 2 раза, 1 табл.

СОКОВ СОВЕТСКИХ

СОЦИЯЛИСТИЧЕСКИХ

PF:ÑÏÓÁJIÈÊ (сIIс 6 01 К 33/535

ГОСУДЛРСТВЕННОЕ IIATEHTHOE

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4768810/14 (22) 11.12.89 (46) 07.12.92. Бюл. Мт 45 (71) Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (72) В.И.Литвинов, Л.Н.Черноусова, B.È.Ãîлышевская, А.Н,Марков, Н.В.Куликовская и В.А.Пузанов (56) Об унификации бактериологических методов исследования. Приказ М3 СССР

М 558, 1978. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕ3А (57) Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к способам определения микобактерий туберкулеза.

Целью изобретения является ускорение способа и повышение чувствительности диагностики. В среде для культивирования микобактерий после посева мокроты, методом непрямого иммуноферментного анализа в сроки 1-3 недели определяют антигены миИзобретение относится к области медицины и биологии, а именно, к способам определения микобактерий туберкулеза.

Прототипом данного метода является определение микобактерий в мокроте бактериоскопическим и бактериологическим методами.

Однако при массовом исследовании бактериоскопический метод дает только 4060% положительных результатов, а результаты бактериологического исследования (посева) бывают положительными только у половины больных с положительным результатом бактериоскопии и лишь у 10-20% с отрицательным результатом. При этом по„„Я.) ÄÄ 1780006 А1 кобактерий туберкулеза с помощью моноклональных антител МГ-1 и антител из гипериммуных сывороток к микобактериям туберкуле за штамма H37RV. Для этого на полистироловые 96-луночные планшеты наносят моноклональные антитела, затем смыв с питательной среды, на которую была посеяна мокрота больного, затем антитела из гипериммунной сыворотки к микобактериям туберкулеза. реакцию проявляют антителами против глобулинов кролика. меченными пероксидазой хрена и истощенными на глобулинах мыши. После добавления ортофенилендиамина с перекисью водорода измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности на

0.2 единицы и больше по сравнению с контролем считают положительной реакцией. По сравнению с прототипом сокращаются сроки диагностики туберкулеза в среднем в 2 раза. 1 табл. ложительные результаты посева удается получить в сроки от 2-Зх недель (50% среди положительных результатов посева) — до 2-х месяцев.

Целью изобретения является ускорение способа и повышение чувствительности диагностики туберкулеза.

Способ осуществляют следующим образом.

В среде для культивирования микобактерий методом непрямого твердофазного. иммуноферментного анализа (ИФА) в сроки

1-3 недели определяют антиген микобактерий с помощью моноклональных антител

МТ-1 и антител из гипериммунных сыворо1780006 ток к микобактериям таубер,óëåçà видя !

human штамма H37RV. В качестве диагностических препаратов используют моноклоняльные антитела к антигену микобактерий—

МТ-1 (регистрационный ¹ 488 Д во Всесоюзном банке клеточных культур) и глобулинову:о фракцию, полученную осяжденлем сульфатом аммония при ЗЗ j, насыщении из гипериммунных сывороток к микобактериям туберкулеза штамма Н37Р, Для определения микобактерий туберкулеза мокроту после обработки в щелочной соеде залива.от в количестве 0,2 мл на плотную питательную среду с добавлением жидкой питательной среды Е!кольниковя с 10%ным содержяниe l плязг1ы. K jnbT раль-lgt0

;кидкость исследуют, начиная с 1-ой недели.

При постановке ИОА на полистироловые

i1ланшеты наносят 25 мкл моноклональных антител МТ-1 в концентрации 100 мкг/мл, и инкубируют 1 ч в термостате при 37 С, зягем отмывают трижды (50 viKfl) забуференным физиологическим растворо14 с

0,05%-твина-20 (Зс!? Р-твин) и в течение 1 ч блокиру от раствором 8G- Ð-твин с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (ЗЗРтвин-БСА), после отмывания ЗФР-твином (грижды по 50 мкл) в лунки наносят по 25 мкл культуряльной жидкости, инкубируют в течение 1 ч при 37 С» после отмывания

ЗФР--;вином (трижды по 50 мкл) наносят по

25 мкл глобулиновой фракции кроличьей runериммунной сыворотки к микобактериям .уберкулезя видя humanus, штамма Н37Р.

После инкубяции в течение iчаса в термостare и отмывания 3 Ф Р-твином (трижды по

50 мкл наносят по 25 мкл антител, против глобулинов кролика, и меченных пероксидязой хрена и ис:ощенных на глобулинах мыши. После инкубации в течение ча "а в термостате и отмывания 3 О Р-таином (трижды по 50 мкл) реакцию проявляют добавлением субстрата -- 25 мкл ортофенилендиаминя с перекисью водорода в цитратно-фосфатном буфере рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл

1,25 Н серной кислоты. Реакцию оценивают спектрометрически при длине волны

492 Ну

Пример 1. Производят забор мокроты и посев ее, Начиная с 1-ой недели, исследуют культуральную 1кидкость на наличие микобактерий туберкулеза, сравнивая с отриuательным и положительным контролем. В качестве отрицательного контроля используют культуральную жидкость после посева

5 мокроты от больного хроническим бронхитом, в качестве положительного — стандарт— специально отобранную культуральную жидкость после посева мокроты от больного туберкулезом легких. Превышение уровня

10 иммуноферментной реакции на 0,2 единицы оптической плотности и больше, чем в отрицательном контроле, свидетельствует о положительной реакции. Использование положительного контроля необходимо для

15 проверки точности проведения реакции.

Так, было обследовано 64 больных туберкулезом легких (инфильтративный и очаговый, впервые выявленный) — окончательный диагноз был установлен на основе

20 комплекса клинико-лабораторных признаков и результатов лечения. Результаты сопоставления бактериологического и иммунологического исследований представлены в таблице.

25 Таким образом, предложенным способом было выявлено 49 случаев туберкулеза из 64-х, причем в срок 2 недели у 50% больных. по сравнению с 23 jp больных, выявленных бактериологическим методом. У

30 больных хроническим бронхитом микобактерии в мокроте обнаружены не были.

Сопоставление результатов определения микобактерий микробиологическим и иммуноферментн ым методами (исследова35 ны кульгуры от 64 больных) приведено в таблице, Формула изобретения

Способ диагностики туберкулеза, включающий забор крови, высев ее на селектив40 ную среду, инкубирование с последующим выявлением бактерий туберкулеза, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени диагностики, после инкубирования

45 производят смыв, выявляют в нем антигены бактерий туберкулеза иммуноферментным методом с фиксированными на твердой подложке моноклональными антителами типа

УГ-1 с вторичными антителами из гиперим50 мунной сыворотки к микобактериям туберкулеза штамма H37RV и при наличии антигена диагностируют туберкулез.

1780006

Составитель В.Литовченко

Редактор С.Кулакова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор T,Ïàëèé

Заказ 4433 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101