Способ стерилизации растительных эксплантов
Использование: сельское хозяйство и биотехнология, для культивирования растительных тканей. Сущность: стерилизацию растительных эксплантое осуществляют путем обработки их 96%-ным этанолом. после чего в течение 30-60 мин выдерживают в 0.1-1,0%-ном растворе беномила и дополнительно обрабатывают 6-10%-ным раствором тексанита в течение 15-30 мин. 1 з. п. ф-лы, 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 Н 4/00
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ,Ю
,О (л)
1(Л О
> (л) (21) 4848037/13 (22) 29.05.90 (46) 23.01.93, Бюл. ¹ 3 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт агролесомелиорации (72) Г. П. Архангельская (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт агролесомелиорации (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 1311673, кл. А 01 Н 3/00. f985.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и семеноводстве для ускоренного размножения гибридного материала. а также в лесном хозяйстве при микроклональном размножении элитного посадочного материала в лесных и плодовых питомниках.
Цель изобретения снижение токсичности стерилизации и пг>вышение жизнеспособности эксплантов.
Пример 1. Стерилизация эксплантов летнего периода отбора
Полуодревесневшие побеги робинии с удаленными листьями моют трижды горячей водой с мылом. ополаскивают и переносят в кювету с дистиллированной водой. которую помещают в стерильный бокс. где в течение часа облучают бактерицидной лампой. 3атем побеги режут на сегменты длиной 15 — 20 мм с одной пазушной почкой и помещают в раствор стерилента. В качестве стерилентов испытывались растворы тексанита, хлорной извести и этанол. а также испытывался ва„„Я „„1790350 А3 (54) СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ (57) Использование: сельское хозяйство и биотехнология, для культивирования растительных тканей. Сущность: стерилизацию растительных эксплантов осуществляют путем обработки их 96%-ным этанолом. после чего в течение 30 — 60 мин выдерживают в
0,1 — 1,0%-ном растворе беномила и дополнительно обрабатывают 6 — 10%-ным раствором тексанита в течение 15 — 30 мин. 1 з. и. ф-лы, 2 табл. риант стерилизации сначала в этаноле, а затем в растворе хлорной извести.
Данные об эффективности стерилентов, приведены в табл. 1, Полученные данные свидетельствуют о том, что стерилизация в растворе тексанита обеспечивает высокий выход стерильных эксплантов с сохранением их жизнеспособности, Пример 2, Стерилизация эксплантов зимне-весеннего периода отбора, Однолетние побеги перед основной стерилизацией готовят анвлогичным образом, Подготовленные сегменты погружают на 10 с в 96% ный этанол. после чего в течение 60 мин выдерживают о 0,1 1.0%-ном рвствор.-. беномила. а затем помещают на 15-30 èè в 10%-ный раствор тексанита.
Данные об эффективности стерилизации приведены в табл. 2.
Испытания показали, что обеззараживание в три ступени. описанное в примере 2 (этанол-беномил-тексанит) дает хорошие результаты при стерилизации эксплантов
1790350 длину более 20 мм. сажали для укоренения на среды Мурасиге-Скуга и Гресхофф-цоя, содержащие ауксины — IMK — 0,3-0.5 мг/л и НУК вЂ” 0,1--0,2 vr/n, Наибольшее число побегов (до 95%) укоренилось на средах
Гресхофф-Доя с 0.3 Mr/n IMK и 0.1 мг/л
НУК.
Укоренившиеся пробирочные растения переносили в торфоперегнойные горшочки
"0 с субстратом, состоящим из смеси торфа и перлита в соотношении 1:1. Субстрат увла>княли половинным раствором солей по Мурасиге-Скугу, Сразу после посадки горшочки с растениями переносили в нестационарную
"5 теплицу с мелкокапельным орошением на период акклиматизации, Пересадку растений в открытый грунт производили после того, как корни, разрастаясь. проникали через стенку торфпперегнойного горшочка.
После посадки в открытый грунт растения притеняли деревянными щитами, Приживяемость в теплице и открытом грунте составила 100%, При обработке по предлагаемому способу высокая стерильность вводимого в культуру материала достигается за счет уничтожения экзогенной инфекции сост;iвом тексанит и ле и бным действием си:..-:; . ного препарата беномил. проникаю:ц,, внутрь растительных тканей и унич1о Kаю щего эндогеннуY> инфpêциlо. которой большой степени инфицирован исхпднь:: материал. вычисленный из растущих в ест .— ственных условиях раст ий, 35
Формула изобретения
1. Способ стерилизации растительных эксплантов, включающий обработку раствором бактерицида. отличающийся тем, . что, с целью снижения токсичности стери- 45 лизации и повышения жизнеспособноти эксплантов. обработку осуществляют 6— — 10%-ным раствором гексанита в течение вычлененных в растущих в открытом грунте маточных деревьев, контаминированность которых в зимне-весенний период значительно возрастает. При этом уничтожаются источники эндогеннпй и экзогенной инфекции.
При стерилизации эксплантов, вычлененных с растущих B закрытом грунте оздоровленных маточников (стационарные теплицы в регулярными фитосанитарными обработками), созданных из суперэлитных растений, размноженных в культуре in vitro, достаточно обработки только тексанитом (пример 1).
После стерилизации по одному иэ приведенных примеров сегменты культивируют на питательной среде Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов морфогенеза использовали 6 — БАП и ИМК. Положительный эффект был получен в летний период при посадке полуодревесневших сегментов на питательную среду с 6 — БАП вЂ” 0.4 — 0,5 мг/л в сочетании с ИМК вЂ” 0,05 мг/л и 6 — БАП вЂ” 0,6 мг/л с добавлением 0,5% активированного угля.
Побеги-регенераты пассировали на питательной среде Мурасиге-Скуга с 6 — БАП—
0.1--0.2 мг/л. Работа по пролиферации побегов велась круглогодично, Коэффициент размножения в зимний период был около единицы, B летний период — 2,7 — 4.1.
Образовавшиеся побе и при пересадках резали на черенки или при небольших размерах делили на одиночные побеги либо группы побегов из 2- 3 нт. Побеги. имеющие
15 — 30 мин или 96%"ным этанолом втечение.
10 — 15 с. затем выдерживают в 0.1- 1,0%-nnì растворе беномила в течение 30-60 с и в
6-10%-ном растворе тексанита 15- 30 ин.
2. Способ по п. 1. отличающийся тем, что экспланты летнего периода отбора стерилизуют путем пбработки их раствором тексанита.
1790350
Таблица 1
,! Стерилизующий раствор
1- .
Концентрация стерилента.о, т 1l
Экспозиция 1 Инфицирован- 1 Жизнеспособность.%: нОсть.%
3.0
3,0
5,0
9.0
80.0
67,0
70.0
30,0
13.0
22,0
93
91
98
Хлорамин
32
21
100 t 00
;:Хлорная известь
1, Этанол
Этанол Хлорная известь Этанол !!Хлорная известь Тексанит
6.0
30
23
99
Таблица 2
:I Дата стерили1 Зации
Экспозиция
1 ванность,%
,Январь
100
33
30 мин
10 с
30 мин
10 с
60 мин
30 мин
96
96
1,0
10!
100! ,„; Февраль
30 мин
10 с
30 мин
10 с
60 мин
30 мин
37
Inn
100
;, Март !
1 !
30 мин
10 с
30 мин
10 с
30 мин
30 мин
100
100
30 мин
10 с
30 мин
10 с
60 мин
96
96
1,0
47
37!
Тексанит
Эта нол ,Тексанит
,,Этанол
1БЕНОМИЛ
Тексанит
Г\ и
93
10 30 мин
=l., Стерил
;: щий ра
;Тексани
I, Этанол
Тексанит, Этанол Беномил
Тексен ит
t !
;Тексанит Этанп
1ТЕкСани
iЭтанол ! .Беномил
1Тексанит ! ! Тексанит ,Этанол !
Тексанит !
Этанол, Беномил
1 . Текс:» т
30 мин
40 мин
30 мин
5 мин
10 мин
15 мин
10 с
15 с
25 с
10 с
5 мин
10 с
15 мин
5 мин
10 мин
15 мин
96
96
10,0
96
96
1,0
), ",, ность, О,
