Способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы

 

Использование: сельское и лесное хозяйство , для получения посадочного материала ценных видов березы. Проводят клональное микроразмножение гибридов карельской березы путем посева верхушечных и пазушных почек на агаризованную питательную среду Мурасигэ-Скуча, содержащую , мг/л: лизин 80-120; кинетин 0,05- 0,15; 6-бензиламинопурин 0,6-1.0 и НУК 0,05-0,08, после этого проводят субкультивирование и удлинение полученных побегов на питательной среде при концентрации 6- бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л индолилмасляной кислоты 0,3-0,5 мг/л, а укоренение осуществляют на жидкой питательной среде Мурасига-Скуча, содержащей дополнительно 0,4-0,6 мг/л индолилмасляной и 0,1-0,3 мг/л нафтилуксусной кислоты, 11 табл. СО с До разработки технологии клонального микроразмножения, Позволяющей получать растения генетически идентичные исходному , ценные гибриды и клоны карельской березы не могли быть использованы для создания.промышленных плантаций на древесное сырье высокого декоративного качества . Известны способы клонального микроразмножения некоторых видов березы, в частности японской белой березы, березы бородавчатой, бурой свилеватой карельской березы. Апробация данных способов на уникальных гибридах карельской березы ел ю ю 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

5Ы 1752284А 1 я)5 А 01 Н 4/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР ф л, !1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4834032/13 (22) 02.04.90 (46) 07.08.92. Бюл. М 29 (71) Ботанический сад Института биологии

Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) Р.К, Байбурина, Н.В. Старова и В.И, Ер маков (56) Akiro Saito. In vitro plantlet regeneration

from adventitious buds induced on cuttings of

peeled twigs of Japanese white birch.—

Joarnai Japan Forestry Soc, 67,7, 1985, р, 282-284, V,Chalupa. Rychle vegetatlvni mnozeni

nekterych Ilstnatych Iesnich lr. vitro.—

Lesnictvi, 2о; 1983, s. 309 — 320.

Maischke J., Evald D„BoiIand G„

Schneck Н. Moglichkeiten der beschleunigten

venmenrung чоп Braunmaserbirken, — Вериг.

Гогзьч! пзсЬатт. 21, 1, 1987, S. 21-25, Leena Ryynanen, Martti Ryynanen.

Propagation of adult curlybirch Succeeds with

tissue culture. — Silva Fennika. 20, 1986, р.

139 — 147, Изобретение относится к биотехнологии и воспроизводству лесных древесных растений в лесном хозяйстве, . Береза карельская характеризуется необычной структурой древесины, ее декоративность высоко ценится на мировом рынке, При семенном размножении лишь у небольшой части растений проявляется узорчатая структура древесины. Сохранить этот хозяйственно-ценный признак можно лишь вегетативным размножением.

Однако вегетативное размножение ее черенкованием затруднено, а прививками дает небольшой процент выхода. (54) СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ГИБРИДОВ КАРЕЛЬСКОЙ

БЕРЕЗЫ (57) Использование: сельское и лесное хозяйство, для получения посадочного мате- риала ценных видов березы. Проводят клональное микрораэмножение гибридов карельской березы путем посева верхушечных и пазушных почек на агаризованную питательную среду Мурасига-Скуча, содержащую, мг/л; лизин 80 — 120; кинетин 0,050,15; 6-бензиламинопурин 0,6-1.0 и НУК

0,05-0,08, после этого проводят субкультивирование и удлинение полученных побегов на питательной среде при концентрации 6бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л индолилмасляной кислоты 0,3-0,5 мг/л, а укоренение осуществляют на жидкой пи-; тательной среде Мурасига-Скуча, содержащей до пол н ител ьно 0,4-0,6 мг/л индолилмасляной и 0,1-0,3 мг/л нафтилуксусной кислоты, 11 табл.

До разработки технологии клонального микрораэмножения, позволяющей получать растения генетически идентичные исходному, ценные гибриды и клоны карельской березы не могли быть использованы для создания,промышленных плантаций на древесное сырье высокого декоративного качества, Известны способы клонального микроразмножения некоторых видов березы, в частности японской белой березы, березы бородавчатой, бурой свилеватой карельской березы, Апробацля данных способов на уникальных гибридах карельской березы

1752284 селекции В.И. Ермакова не дала положительных результатоа.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ клонального микроразмножения взрослых растений свилеватой карельской березы, Способ включает четыре этапа; введение в культуру верхушечных и пазушных почек и инициация роСта каллуса на среде Мурасйге и Скуга (MS-1A) с

1 мг/л БАП в течение двух недель; индукция почкообразования на среде с 10 мг/л БАП, 0,2 мг/л НУК в течение 2-3 недель; удлинение побегов на среде М$ с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей, 0,5 мг/л . БАП, 0,5 мг/л ИУК втечение четырех недель; укоренение на среде MS с половинным содержанием макросолей и сахарозы, без гормонов в течение четырех недель.

Недостатками данного способа являются многоступенчатость технологии (4 этапа), что связано с дополнительными экономическими и временными затратами (12-13 недель), относительно низкий процент укореняемости и приживаемости растений при высадке в открытый грунт, высокий процент инфицирования и гибели регенерантоа на этапах культивирования. Кроме того, повышенное использование БАП на втором этапе (10 мг/л) может вызвать- нежелательные изменения в генотипе, а длительность укоренения без гормонов (до четырех недель) нежелательна для развития побегов, Целью изобретения является увеличеwe выхода растений — регенерантоа гибридов карельской березы и сокращение сроков выращивания, Цель достигается тем, что согласно способу клонального микроразмножения гибридов карельской березы в качестве исходных зксплантов используют верхушечные.и пазушные почки гибридов карельской березы, рост каллуса и формированйе конгломерата микропобегов проводят на основной агаризоаанной питательной среде по

Мурасиге и Скугу с добавками 80 — 120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетина, 0,61,0 мг/л БАП (бензиламинопурина), 0,050,08 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота) (среда 1), с последующим субкультйвированием и удлинением побегов на основной агаризованной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и сахарозы и с дополнением 0,4-0,6 мг/л БАП, 0,3 — 0,5 мг/л

ИУК(среда 2), укоренение растений — регенерантов проводят на основной жидкой питательной среде с дополнением 0,4 — 0,6 мг/л

ИМК (индолил-3-масляная кислота), HYK

0,1-0,3 мг/л (среда 3). Культуры выращивают при освещении люминесцентными лам40

55 недель. Среда 2 с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей содержит 0,40,6 мг/л БАП и 0,3 — 0,5 мг/л ИУК, 10 г/л сахароэы и 0,4%-ный агар, На среде 2 проводят мультипликацию побегов, т, е., помещая выросшие побегй, подрезав с основания и удалив верхушку, на свежую среду, можно; повторяя этот процесс многократно, добиться выхода максимального числа побегов из одного экспланта.

Выросшие до 2,0 — 3,0 см растения пересаживают на жидкую питательную среду 3 для корнеобразования. Эта среда состоит из минеральных солей по Мурусиге и Скугу с добавками лизина 80 — 120 мг/л, ИМК 0,40,6 мг/л, НУК 0,1 — 0,3 мг/л, сахарозы 20 г/л, На этой среде побеги формируют корни а течение 10-15 дней. По достижении корнями 3-5 см в длину растения пересаживают а почвенную смесь с торфом. Горшки с растениями ставят в теплицу для доращивания, Способ апробирован в лабораторнопроизводственных условиях.

Пример 1. Материалом для размножения служат гибриды карельской березы, пами (10000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25 С и относительной влажности воздуха 70%. Укорененные растения-регенеранты выса>кивают в почву а теплицу с последующей высадкой в открытый грунт, Способ осуществляют следующим образом.

Молодые неодреаесневшие побеги текущего года длиной 3-5 см обмывают в слабом мыльном растворе, а затем промывают водопроводной водой. Растительный материал Сначала стерилизуют в ламинаре в течение 1 мин а 70% этаноле, а затем — 3 мин в диациде, По окончании стерилизации промыаают трехкратно аатоклавироаанной дистиллированной водой.

В стерильных условиях вычленяют пазушные почки и помещают в питательную среду в пробирки. Среда 1 для культиаиро20 вания почек с последующим образованием и ростом каллуса содержит, кроме основной среды по Мурасиге и Скугу (Murashlge, Skoog, 1962), 80- 320 ìã/л лизина, 0,050,15 мгlл кинетина, О;6-1,0 мг/л БАП; О;05—

0,08 мг/л НУК, сахарозу 20 г/л, агар 0,4%

На этой среде через.три недели образуется плотный каллус желтовато-бурого цвета. Через дае недели он увеличивается в массе и наблюдается многочисленное образование почек зеленого цвета с последующим появлением укороченных побегов с молодыми лис-;ьями, Затем этот каллус с образовавшимся конгломератом глзленьких побегов переносят на среду 2, на которой происходит удлинение побегов в течение 3-4

1752284

15

НУК 0,065 мг/л (оптимальные концентрации) 20 автоклавировали при 1 атм в течение 30 мин, воду — при 1,5 атм в течение 1 ч, Эксйланты помещают на питательную среду 1 в биологические пробирки (21 х 200 мл), которые закры25

30 субкультивируют на среде для элонгации .35 (оптимальные концентрации), сахарозы 50

20 г/л. По достижении корнями 3 — 5 см в длину растения пересаживают в почвенную смесь с торфом. Горшки с растениями ставят в теплицу для доращивания. Полив обильный, Приживаемость растений со- 55 ставляет 76%. Наблюдения показывают нормальный рост и развитие растений, Сравнение результатов каллусообразования показывает, что процент каллусообразования у предложенного способа полученные под руководством В.И. Ермакова и произрастающие на агробиостанции.

Пазушные почки взяты со взрослых деревьев, возраст которых 18-23 года.

Молодые неодревесневшие побеги длиной 3 — 5 см отрезают, поверхностно стерилизуют в растворе детергента, а затем промывают в проточной воде. В стерильных условиях (в ламинаре) кусочки побегов сначала стерилизуют в течение 1 мин в 70%ном этаноле, а затем в диациде 3 мин. По окончании стерилизации промывают трехкратно автоклавированной дистилированной водой. После этого в стерильных условиях (шкаф с ламинарным течением воздуха) отделяют почки от побегов, удаляют у них покровные чешуи, Пробирки со средой 1 (табл. I) с добавками лизин

100 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, БАП 0,85 мг/л, вают стерильными марлевыми пробками.

Пробирки помещают на светоплощадку при освещении люминесцентными лампами (10000 лк) на 16-часовом фотопериоде при

25ОС и 70% относительной влажности воздуха. Через три недели на нижней части почки образуется каллус желто-бурого цвета, который, спустя 2 недели, увеличивается в массе, наблюдается массовое образование почек зеленого цвета. Этот каллус далее побегов, Для элонгации побегов используют среду 2 (табл. 1), которая представляет собой основную среду с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и с дополнением

0,5 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИУК (оптимальные концентрации), сахарозой 10 г/л и агаром

0,4%. На этой среде проводят мультипликацию побегов. Побеги гибридов, достигшие

2,0 — 3,0 см, в течение трех недель пересаживают на жидкую питательную среду 3 для корнеобразования (табл. 1), состоящую из минеральных солей по Мурасиге и Скугу с дополнением ИМК 0,5 мг/л, НУК О, 2 мг/л

45 (83,6%) выше, чем даже на лучшей из сред для инициации каллуса (MS- iA) у известного (82,7%).

На этапах культивирования (этапе 1-4) у известного способа случаи бактериального инфицирования и гибели составляют

40-101%, В предложенном способе инфицирования и гибель эксплантов наблюдается только на этапе 1 (табл. 2), что составляет в среднем 16,4%, на этапах органогенеза (этапы 2 — 3) инфицирования и гибели регенерантов не наблюдают (табл, 3).

Сравнение результатов укоренения in

vitro показывает, что предложенный способ позволяет достигнуть укоренения in vitro y деревьев всех испытанный гибридов (например, у гибрида 32 из 32 побегов 22 укореняются сразу на среде 3, а 10 инертных побегов после повторного помещения на среды 2, 3 тоже дают корни). в тоже время у известного способа укоренение in vitro достигнуто не у всех деревьев и процент укоренения низок из-за инфицирования и гибели регенерантов на этапах 2-4 (40101%);

В предложенном способе приживаемость растений, высаженных в грунт, составляет в среднем 76%, в известном способе данные по приживаемости не приводятся.

Предложенный способ позволяет проводить культивирование взрослых деревьев карельской березы в укороченные сроки 1011 недель (известный способ 12-13 недель) за 3 этапа (табл. 4).

Пример 2. С молодых неодревесневших зеленых побегов отделяют пазушные почки и культивируют их на питательной среде 1 с различными концентрациями гормональных веществ. В процессе экспериментов выявлены предельные значения и оптимальные концентрации кинетина, БАП, ИУК, НУК, лизина соответственно. Результаты представлены в табл. 5-8.

Пример 3. Растительный материал тот же, что и в примере 1 и 2. После культивирования на среде 1 полученные множественные микропобеги отделяли и субкультивировали индивидуально на среде

2 с различными концентрациями БАП и ИУК, с целью удлинения. Экспериментально определяют предельные и оптимальные концентрации БАП и ИУК соответственно.

Результаты представлены в табл. 9 и 10.

Пример 4. После культивирования на средах 1 и 2 выросшие микропобеги пересаживают на среду 3 для стимулировайия образования корней с различными концентрациями ИМК, Экспериментально определяют предельные значения и опти1752284 мальные концентрации ИМК. Результаты приведены в табл, 11, В культуру вводят растения нескольких гибридных комбинаций. Преимуществами предлагаемого способа являются: возможность промышленного использования в лесном хозяйстве уникальных гибридов карельской березы с ценной древесиной, которые ранее не могли быть использованы в производстве вследствие трудности их размножения черенкованием; возможность размножения взрослых деревьев; воэможность многократной мультипликации; сокращение сроков получения укорененных растений до 10-11 недель; подготовка укоренившихся растений s условиях теплицы к началу вегетации в открытом грунте; возможность выращивания посадочного материала независимо от времени года.

Среды, используемые для клонального микроразмножения гибридов карельской березы, представлены в табл. 1.

Результаты каллусообразования у предложенного и известного способов представлены в табл. 2.

Результаты размножения гибридов карельской березы (сентябрь-октябрь 1988 г,) представлены в табл. 3.

Этапы культивирования и их длительность у предложенного и известного способов приведены в табл, 4.

Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации кинетина приведены s табл. 5.

Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации BAll представлены в табл. 6. . Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации НУК приведены в табл. 7.

Результаты роста каллуса и формирования конгломерата молодых побегов в зави. симости от концентрации лизина приведены в табл, 8, 5 . Результаты удлинения побегов в эависймости от концентрации GAll приведены в табл, 9.

Результаты удлинения побегов в зависимости от концентрации ИУК приведены в

10 табл. 10.

Эффективность корнеобразования в зависимости от концентрации ИМК приведена в табл, 11.

15 Формула изобретения

Способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы, включающий посев верхушечным и пазушных почек на агаризованную питательную среду Мура20 сиге-Скуга, содержащую в своем составе фитогормоны, культивирование до получе-.. ния побегов, их удлинение на питательной среде Мурасиге-Скуга с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и содержащей в

25 качестве фитогормонов 6-бемзиламинопурин и индолилуксусную кислоту с последующим переносом на питательную среду для укоренения, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода растений-pere30 нерантов и. сокращения сроков выращивания, посев верхушечных и пазушных почек проводят на питательную среду, содержащую в качестве фитогормонов 80 — 120 мг/л лизина, 0;05-0,15 мг/л кинетина; 0,635 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина и 0,050,08 мг/л НУК. субкультивирование побегов и их удлинение проводят на питательной среде при концентрации 6-бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л и индолилмасляной

40 кислоты 0 3-0,5 мг/л, а укоренение осуществляют на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно

0,4-0,6 мг/л индолилмасляной и 0,1— 0,3 мг/л нафтилуксусной кислоты.

1752284

10 мг/л

Среда

)" (ю й

1650

Умень- — + шенная

+ вдво е концен- + трация

190.0

440

370

170

37,3

27,8

6,2

22,3

8,6

0,83

0,25

О, 025

0,025 +

10000

20000

0,5

Тиамин НС1

Инозит

Глицин

0,1

100

2,0

80-120

Лизин

0,05-0,15

Кинетин

БАЛ

ИУК

НУК

ИМК

0,1-Э,З

0,05-0,08

0,4-0,6

Ы

Состав основной среды по Мурасиге и Скугу

ИН .1О кяо .

СаС1 . 2Н О ма804 7Н20 .КНуРО

Ма ЭДТА.2Н О

FeSO 78 О

З 3

М 80„4Н,О

ZnSOy 7Н О

Na>Mo0> ° 2Н О

CuSO 5Н О оС! 6HO

Сахароза

Никотиновая кислота

Пиридоксин HCl

Таблица 1

0,6-1,0- 0,4-0,6

0,3-0,5 ююв ююйююююююеююююв

1752284

Табли ца 2

Способ

Известный

Предложенный

Среда

32 ИВ-1А

1 ) Количество вводимых в культуру эксплантов, шт.

15

Количество образовавшихся каллусов» шт

46 3 16 4 4 24

83,63 253 411 26,73 44,4 82,7

Процент каллусообразования

Таблица 3

Количество по бегов от одного каллуса, шт

Гибриды

Высажено в грунт, шт

Количество ускоренных растений in

vitro, шт

Прижилось в грунте, шт

Количество вве- Количество обденных в куль- разовавшихся туру эксплан- каллусов, шт тов, шт

22

29

32

41

22

29

17

22

12

9

23

32

368

589

П р и м е ч а н и е. Данные приводятся без учета процессов субкультивирования каллуса и мультипликации побегов, которые позволяют многократно увеличивать выход растений — регенерантов от одного экспланта.

Не укоренившиеся сразу побеги (32-22- 10 у гибрида 32) не инфицируются и не погибают, а повторно помещаются на свежие среды 2 и 3, гле позднее дают корни. Инфицирования и гибели регенерантов на этапах 2 и 3 не ваблюдалось.

Таблица 4

Длительность этапов, не ели

Способ

Этапы культивирования

Время культивирования, не ели

Предложенный

Введение в культуру, каллусообразование, индукция почек

Элонгация побегов

Корнеобразование

Введение в культуру, каллусообразование

Индукция почек

Элонгация побегов

Ко необ азование

10 — 11

3-4

Известный

2 — 3

12-13

Таблица 5

Процент инфицирования и ги бели эксплантов 16,4Ж:753 - 593 73,33 55,64 17,3Ф, .

П р и м е ч а н и е. В культуру вводились экспланты от 10-20 деревьев каждого гибрида.

Здесь и в последующих таблицах даны данные по одному дереву от каждого гибрида, так как результаты по деревьям от одного гибри да не варьировали. 8 предложенном способе в культуру вводились экспланты от трех гибридных комбинаций (32, 368, 589), в изве- стном - от пяти плюсовых деревьев (Е 8469, Е 8999, Е 9000, Е 9141, Е 1092) . с

16

Таблица.б

1752284

Таблица 7

Табл.ица 8

Таблица 9

Таблица 10

Таблица 11

Составитель P.Áàéáóðèíà

M. емчик

Редактор Г.Гербер

Техред М,Моргентал Корректор Й

Заказ 2710 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101