Способ получения вакцины против колибактериоза цыплят

 

Использование: микробиологическая промышленность, ветеринария, иммунопрофилактика колибактериоза цыплят. Сущность изобретения: выращивание Е. coli ведут глубинным способом при постоянной аэрации, перемешивании и автоматическим регулированием рН после 5 ч роста в пределах 7,0-7,2. Инактивацию и осаждение клеток проводят двумя объемами ацетона с последующим центрифугированием, высушиванием и измельчением осадка. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si>s А 61 К 39/108

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4801734/13 (22) 12.03.90 (46) 30.01,93. Бюл, ¹ 4 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) В.Ю.Грибаускене. Т.Ю.Падегимас и

А,Б.Равиленене (73) Институт прикладной энзимологии

"Ферментас" (56) Патент США ¹ 4343792, кл. А 61 К 39/00, 1982.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к разработке технологии получения коливакцины, которая может быть использована в ветеринарии для иммунопрофилактики колибактериоза цыплят.

Известен способ получения коливакцины при выращивании Escherlchla coll на питательной среде следующего состава, мас.

%: агар-агар 1,0 — 2,0, пептон 0,1-0,5, глюкоза 0,1 — 0,5, асперагиновая кислота 0 — 0,4, дезоксихолат натрия 0 — 0,2, дрожжевой экстракт 0 — 0,1, минеральные соли (MgS04, MnClz, FeCIz, СаС12) 0,001-0,00001.

Колибактерии выращивают поверхностным способом при температуре 37"С, после бактерии смывают буферным раствором с поверхности агара до концентрации клеток от 10 до 10 /мл. Следующим этапом получения вакцины является инактивация бактериальных клеток при помощи химических и физических средств, Как химическое средство применяется формальдегид, а в качестве физического фактора применяется облучение гамма лучами с добавкой окиси.. Ж 1792330 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА ЦЫПЛЯТ (57) Использование; микробиологическая промышленность, ветеринария, иммунопрофилактика колибактериоза цыплят. Сущность изобретения: выращивание Е. coll ведут глубинным способом при постоянной аэрации, перемешивании и автоматическим регулированием рН после 5ч роста в пределах 7,0-7,2. Инактивацию и осаждение клеток проводят двумя объемами ацетона с последующим центрифугированием, высушиванием и измельчением осадка. 2 табл. алюминия или сапонина. После инактива- (/ ) ции клеток проводится сепарирование. 1

Недостатком этого способа является применение метода поверхностного культивирования колибактерий, небольшой выход количества клеток и получение вакцины в жидком виде. юаЗ

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является получение вакцины против колибактериоза птиц при выращивании раздельно штаммов Е, coli ¹

211 и № 216 глубинным способом в условиях аэрирования до получения бактериальной массы 20-30 млрд. микробных тел/мл в буввонв Хоттннгвда с добавкой глюкозы. инактивирование формалином в количестве

0,2 — 0,4% в течение 3 — 4 суток при температуре 37-38 С, Бульонные культуры центрифугируют в течение 35-40 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок разбавляют забуференным физологическим раствором рН 7,2 — 7,9. Полученную взвесь культур штаммов соединяют в равных объемах (1:1) и консервируют

1792330

Недостатком этого способа является применение дорогой питательной среды— бульона Хоттингера, получение небольшого выхода количества клеток, получение вакцины в жидком виде, сложность и длитель. ность технологического процесса, Цель изобретения —. повышение выхода вакцины, упрощение и ускорение способа, Это достигается путем выращивания Ecsherichia coii глубинным способом при регулировании аэрации и рН среды на питательной среде следующего состава, мас. %:

Крахмал осахаренный i,5

Пептон .1,5

Кукурузный экстракт 0,75

Вода водопроводная Остальное

Далее проводится концентрирование культуральной жидкости, инактивация и осаждение клеток колибактерий двумя объемами охлажденного до -10 С ацетона, центрифугирование осадка и высушивание в вакуумной сушилке при 35 — 40 С.

Существенным отличием заявляемого способа получения коливакцины является регулирование аэрации и рН среды, что обеспечивает ускорение роста бактерий, На протяжении 8 часов воздух подают из расчета 10 м в час на 1 м культуральной 4 з з жидкости, затем подачу воздуха увеличивают до 15 м /час, Суть регулирования рН среды в пределах 7,0 — 7,2 заключается в том, что при выращивании колибактерий без регулирования 5 рН питательная среда подкисляется до 4,54.0, что является причиной замедления роста, Число клеток составляет 5-10 млрд./мл.

Подача аммиака в ферментер после 5 часов роста и поддержание рН на одном уровне, 5 резко увеличивает число клеток до 30 — 40 мл рд./мл.

На 12-том часу роста рН в ферментере самопроизвольно подщелачивается до?,67,8, после чего выращивание прекращают. раствором тиомерсана в количестве 0,0050,01 .

Содержание компонентов в полученной вакцине следующее.

Компоненты вакцины Содержание в 1 л

Антигены эшерихия Минимум, максимум (клеток):

Е И %211 4101351013

2.10 2,5.10

E. Сои N -216 2 101ç 2 5 101Ç

Формалин (смз) 2 4

Тиомерсан (см ) 0,05 0,1

Забуференный физиологический раствор до 1 л

Другим отличием является уровень технологического процесса, включающий применение двух обьемов ацетона в качестве . инактиватора и осадителя клеток колибакте5 рий, что обеспечивает получение(после центрифугирования и сушки) сухого препарата коливакцины и упрощает применение ее в широких масштабах в ветеринарии.

Пример. Для глубинного культивиро10 вания колибактерий использовали питательную среду следующего состава, мас, %:

Крахмал осахаренный 1,5

Пептон 1,5

Кукурузный экстракт 0,75

15 Водопроводная вода 96,25

1; Приготовление питательной среды. а) осахаривание крахмала

75 кг нерастворимого крахмала кукурузного заливают 1 м водопроводной воды, з

20 подогревают до 40 С, добавляют 375 г амилосубтилина ГЗх, рН доводят до 6,6, подогревают до 85 С и выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Далее кипятят в течение часа, охлаждают до 75 С, 25 добавляют 175 r амилосубтилина ГЗх, проверяют качество осахаривания с йодом (не должен дать синего окрашивания), рН доводят до 5,0 при помощи ортофосфорной кислоты, охлаждают до 58 С, прибавляют 12,5

30 л глюкаваморина Гх с активностью 50 едlмл и выдерживают при температуре 58 С в течение 6 часов, Таким образом пригоговленный осахаренный крахмал стерилизуют при температуре 120 С в течение 30 минут.

35 6) приготовление раствора пептона

75 кг пептона растворяют и ри пе ремешивании в 1 м водопроводной воды. з в) приготовление полной питательной среды з

40 К 1 м водопроводной воды при перемешивании прибавляют37,5 кг кукурузного экстракта и 1 м" пептонного раствора. Общий объем воды доводят до 4 м (с учетом, 2D/ конденсата), Растворы кукурузного

5 экстракта и пептона стерилизуют при температуре 130 С в течение 30. минут, После стерилизации компоненты питательной среды, то есть кукурузный экстракт, пептон и осахаренный крахмал объединяют, 0 охлаждают до 38 С, доводят рН до 7 6 и засевают односуточной культурой

Escherichia coli в количестве 0,1О/ по обьему.

2. Получение биомассы колибактерий.

5 Выращивание Е. coii проводят в ферментере емкостью 10 м с рабочим обьемом з питательной среды 5 м глубинным спосоз бом при температуре 38 С в течение 12 часов при постоянном перемешивании и аэрации, причем в первые 8 часов воздух

1792330

Таблица1

Физико-химические показатели коливакцины

Показатели

Ха акте истика

Мето испытания

Мелкий порошок

Светло-коричневый

По ГОСТ 20264.1-74

По ГОСТ 20264.1-74

По ГОСТ 20264 1-74

65

По ГОСТ 4403-77 По ГОСТ 4403-77

О С 0-42-59-86

310 подают из расчета 10 м в час на 1 м кульз туральной жидкости, затем подачу воздуха увеличивают до 15 м /час. После 5 часов роста рН резко падает до 7,0. Для поддержки рН в пределах 7,0-7,2, автоматически включают подачу аммиака, На 12-том часу роста рН в ферментере самопроизвольно подщелачивается до 7,6, после чего выращивание прекращают.

С 5-часового возраста каждый час определяют популяцию и количество клеток в одном мл культуральной жидкости при помощи отраслевого стандартного образца мутности {ОСО 42-28-85-86).

3. Получение целевого продукта, После прекращения выращивания культуральную жидкость концентрируют, охлаждают до 4 "С и осаждают 2-мя объемами охлажденного до -10 С ацетона. Ацетон добавляют небольшими порциями при непрерывном перемешивании. Полученный осадок центрифугируют, высушивают в вакуумной сушилке при 35 — 40 С и измельчают, В полученной по такому способу сухой вакцине определяют количество клеток, которое cocTBBëÿåò 3 10 в грамме (средние данные 5-ти опытов), Па физико-химическим показателям коливакцина должна соответствовать требованиям, представленным в табл, 1, Целесообразность применения двух объемов ацетона для получения коливакцины показана в табл, 2, Как видно из данных, представленных в табл. 2, оптимальный выход целевого продукта получен при осаждении двумя объемами ацетона.

ВнешниЙ вид

Цвет

Массовая доля влаги, «/ не более

Крупность помола: проход через сито

N 38, не менее остаток на сите

N 27, не более

Количество клеток в грамме препарата

Применение предлагаемого технологического процесса обеспечивает возможность в 100 раз увеличить выход. количества клеток колибактерий и сократить технологи5 ческий процесс.

Получение коливакцины в виде сухого . препарата упрощает применение ее в широких масштабах в ветеринарии для иммунопрофилактики колибактериоза цыплят.

10 Формула изобретения

Способ получения вакцины против колибактериоза цыплят, включающий глубинное выращивание культуры Escherichia соИ в питательной среде в условиях аэрации, 15 инактивацию полученной культуры, ее концентрирование с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода вакци20 ны, упрощения и ускорения способа, используют питательную среду следующего. состава, мас. :

Крахмал осахаренный 1,5

25 Пептон 1,5

Кукурузный экстракт 0,75

Вода Остальное. при выращивании культуры в первые восемь часов воздух подают из расчета 10

30 м /ч на 1 м культуральной жидкости, а заэ тем подачу воздуха увеличивают до 15 м /ч, при атом в процессе выращивания рН среды поддерживают в пределах 7,0-7,2, инактивацию и концентрирование культуры

35 проводят одновременно двумя объемами ацетона, осадок отделяют центрифугированием и полученный целевой продукт высу-g шивают и измельчают, 1792330

Таблицэ2

Количество клеток при осаждении бактерий различным объемом ацетона

Составитель В.Грибаускене . Техред М,Моргентал Корректор С,Лисина

Редактор Н;Павлова

Производственно-издательский комбинат Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 165 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4/5