Штамм бактерий рsеudомоnаs рuтidа - деструктор ароматических соединений и окиси мезитила

 

Использование: утилизация ароматических соединений и окиси мезитила в фенольных сточных водах. Сущность: штамм бактерий Pseudomonas putlda GFS-8 депонирован под номером ВКПМ В-5248. Штамм обладает высокой деструктивной активностью в отношении ароматических соединений , а также окиси мезитила: полностью утилизирует 1000 мг/л фенола за 96 ч. 1 табл.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) Г

В (Г (2 (2 (4 (7 но и м (7 ж (5 кл

19

ar

so

of

СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ДОМСТВО СССР

СПАТЕНТ СССР) АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

) 4908727/13

) 08,02.91

) 07.02.93. Бюл, ¹ 5

) Саратовский филиал Всесоюзного научисследовательского института генетики елекции промышленных микроорганизв

) А.Ю.Федоров, И.Н;Сингирцев, В.И.Корневич, B.Þ.Êðåñòüÿíèíoâ и Е,В,Волченко

) Патент Франции N 2311759, С 02 С 5/10, 1976, Патент США ¹ 4447539, кл, С 12 N 1/20, 2 R 1/40, 1985, Авторское свидетельство СССР

1033542, кл. С 02 F 3/34, С 12 N 1/20, 1.

Arunakumarl А. of al. Ut!Ilzatlon of

matic substances by Pseudomonas

anacearum. // Ind.l,Ехр.Biol„1984, ч.22, 10 р.32 — 36, Masque С. et al, Selection and adaptation

phenoldeg rading strain of Pseudomonas.

В! отесЫ.Lett. 1987, v.9, № 9, р,655-660.

Изобретение относится к прикладной м кробиологии и биотехнологии и заключает я в выделении нового бактериального ш,амма, который может быть использован дл ) очистки сточных вод как фенольного, так и Других, имеющих в своем составе аналогичные соединения.

В состав сточных вод производства феHola и ацетона кумольным способом входят фднол, ацетофенон, Q -метилстирол, окись мезитила, диметилфенилкарбинол, гидропе рекись изопропилбензола (гипериз) и др угие компоненты. Экологическая вредо-! ! (я)5 С 02 F 3/34, С 12 М 1/20 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS

PUTl0A-ДЕСТРУКТОР АРОМАТИЧЕСКИХ

СОЕДИНЕНИЙ И ОКИСИ МЕЗИТИЛА (57) Использование; утилизация ароматических соединений и окиси мезитила в фенольных сточных водах. Сущность: штамм бактерий Pseudomonas puttda GFS-8 депонирован под номером ВКПМ В-5248. Штамм обладает высокой деструктивной активностью в отношении ароматических соедине ний, а также окиси мезитила: полностью утилиэирует 1000 мг/л фенола за 96 ч. 1 табл. носность данных сточных вод обусловлена высокой токсичностью большинства компонентов и усиливается при их смешении.

Фенол является целевым продуктом указанного производства и поэтому входит в состав сточных вод в качестве основного компонента. Кроме того, он входит в состав стоков производства фенолформальдегидных смол, нитро- и хлорфенолов, фенилсульфокислот, капролактана, салициловой и пикриновой кислот и других ароматических соединений. Предельно допустимая кон1792925 центрация фенола в воде составляет 0,001 мг/л.

Ацетофенон в процессе производства фенола и ацетона образуется при кислотном гидролизе гипериза. Он может встречаться также в сточных водах парфюмерной промышленности, где используется в качестве душистого вещества, и в сточных водах фармацевтических производств, ПДК в воде 0,1 мг/л, Кроме того, при обеззараживании воды путем хлорирования (в частности, на очистных сооружениях) ацетофенон может превращаться в хлорацетофенон — отравляющее вещество — лакриматор с непереносимой концентрацией 0,005 мг/л/ 2 мин, 15 а-Метилстирол получается при кислотном гидролизе гипериза, при дегидратации диметилфенилкарбинола, при дегидрировании изопропилбензола, в процессе производства фенола и ацетона. а -метилстирол 20 входит в состав сточных вод производства бутадиенметилстирольного каучука, прадприятий органического синтеза и нефтехимического производства. ПДК в воде 0,1 мг/л. 25

В процессе производства фенола из ацетона кумольным способом ацетон, пол.. учающийся в результате разложения гипериза, в присутствии серной кислоты превращается в окись мезитила, Окись ме- 30 зитила применяется также как растворитель эфиров целлюлозы, поливинилхлорида, природных смол, является инсектицидом.

Штаммы, способные утилизировать фенол, известны, Например французские исс- 35 ледователи селекционировали штамм

Nocardia sp, В 87, способный разрушать фенол в концентрации 2000 мг/л. Однако процесс деструкции требовал обязательного присутствия источника азота и углерода. 40

Известны штаммы, способные кроме фенола, утилизировать и другие ксенобиотики. Например, штамм Pseudomonas

putida CB-173 (300 мг/л фенола, за 48 ч, при

30 С) способен разрушать и неионогенные поверхностно-активные вещества, но осуществляет эти процессы на полноценной среде, Известен штамм, разрушающий а-метилстирол (Bacillus cereus М 3,2000 мг/л, за

72 ч). Однако данные о его способности использовать другие компоненты фенольных сточных вод в качестве питательных субстратов отсутствуют.

Известны штаммы, способные разрушать многие ароматические соединения.

Так, например, штамм Pseudomonas

solanacearum способен использовать в качестге единственного источника углерода

46 ароматических субстратов. Однако ни фенол, ни другие компоненты фенольных сточHblx вод не входят в спектр его деструктивной активности.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Pseudomonas sp. QT31, разрушающий фенол в концентрации 1000 мг/л за 36 — 95 ч в зависимости от времени адаптации.

Недостатком всех указанных штаммов является отсутствие у них способности биодеградации широкого спектра субстратов, являющихся компонентами сточных вод производства фенола.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, способного утилизировать компоненты сточных вод производства фенола и ацетона (такие, как фенол, ацетофенон, а -метилстирол, окись мезитила) и сохраняющего свою деструктивную активность в сточных водах.

Предлагаемый штамм депонирован во

Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под регистрационным номером ВКПМ В-5248.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и . физиолого-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки штамма представляют собой короткие палочки с тупыми концами, расположенными одиночно и попарно. грамотрицательные, спор и капсул не образуют, Культуральные свойства. На синтетической минеральной среде М9 следующего состава, мг/л: Ма2НРО4 6000; КН2РО4 3000 мг/л; NaCI 500; NH4CI 1000; агар-агар 15000. содержащей ароматические соединения в качестве единственного источника углерода и энергии после 72 ч инкубирования при

30 С образует колонии диаметром 1,5 — 2 мм правильной округлой формы, гладкие, блестящие, края ровные, Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб, подвижен, каталазо- и оксидазоположителен, образует аргининдигидролазу и уреазу; желатиназу, амилазу, фенилаланиндезаминазу не образует. На среде Хью-Лейфсона образует кислоты из -арабиноэы, L-ксилозы, глюкозы, мальтозы, сахарозы и галактозы. На МПА и Кипг В образует лимонно-желтый флюоресцирующий пигмент.

В качестве единственного источника углерода и энергии способен использовать ацетат, L-арабинозу, сахарозу, малонат, этанол, сорбит, L-аланин, L-глугамин, маннит, сукцинат, глицерин, L-ксилозу, глюкозу, сахарозу, L-рамнозу и лектозу.

1792925

Оптимальные условия культивирования на полноценных питательных средах: рН 7.0 +0,5; ЗО +1 С.

Условия хранения. стерильные столбики (среда М9, агар-агар 7500 мг/л, ацетофенон или фенол в концен рации 500 мг/л), инкубируют при 30 С 72-96 ч, заливают1 мл стерильного вазелинового масла и хранят при 4 С, пересевают 2 раза в год, Чувствительность к актибактериал ьн ым препаратам, Штамм устойчив к линкомицину, ристомицину, бензилпеницилину, олеандомицину; штамм чувствителен к ст1зептомицину. полимиксину, рифампициM), тетрациклину, левомицитину, зрит омицИну, карбеницилину, гентамицину, Патогенные свойства. При внутрибрюшинном заражении беспородных белых мыш и (10 животных на пробу) взвесью су1гочной культуры штамма в концентрации

1 лрд,микробных тел-мл в объеме 0,5 мл на животное заболевания не обнаружено.

Срок наблюдения 7 дней. Это дало сснован е считать культуру штамма непатогенной.

На основании комплекса морфологокул ьтурал ьн ых и физиолого-биохимических

I свойств штамм был идентифицирован как

P eudomonas putIda. л

Пример 1. Получение штамма GFSS.

Штамм Psevdomonas putIda GFS8 был вь1делен из образца почвы, взятого на террИтории предприятия, производящего фен л и ацетон, методом прямого высева почвенной суспензии на агазированную среду М9 следующего состава, мг/л:

Nk2HP0< 6000; КН2Р04 3000; МН С1 1000;

КуС1 500, фенол 500, агар-агар 15000; рН 7,0 й0,2.

Выделенную культуру пассировали на плотной среде того же минерального состава, содержащей постепенно повышающиеся1 концентрации фенола (с 500 до 1125 мг/л), отбирая для дальнейших исследований наиболее крупные колонии.

На среде М9, содержащей 1125 мг/л фенола в качестве единственного источника углерода, рост данной культуры не наблюдался. Клоны, отобранные с плотной синтетической минеральной среды М9 с содержанием фенола 100 мг/л проверяли на способность к утилизации этого субстрата при культивировании на жидкой среде того же состава в колбах на 250 мл, содер>кащих 100 мл среды. Изменение содержаI нИя фенола в среде культивирования койтролировалось спектрофотометрически (2 О нм).

Дальнейшие исследования показали, чтО данный штамм способен помимо фено5

4Q

55 лв метаболизировать также а -метистирол, окись мезитила (500 мг/л), 4-хлор-бензойную кислоту(750 мг/n) и бензамид (500 мг/л) в качестве единственного источника углерода при культивировании на минеральной среде М9 при ЗО С. В результате пассирования по плотным минеральным средам, как описано выше, удалось получить клоны, способные утилизировать более высокие концентрации,ацетофенона 1250 мг/л, окись мезитилэ 1000 л1г/л.

П р и л е р 2. Использование штамма

GFS8 в качестве единственного деструктора фенола в условиях периодического культивирования на круговой ка .алке.

Суточную культуру штамма GFS8, выращенную на агаризованной полноценной питательной среде, отмывали трехкратным центрифугированием при 6000 об/мин в

0,9ь-ном растворе хлорида натрия. 1 мл суспензии (10 клеток/мл) вносили в колбу на 250 мл, содержащую 100 мл неагаризс.ванной среды I49 (состав среды сМ.ïðèìåð

1) и 1000 мг/л фенола в качестве единственi ого источника углерода и энергии, Культивирование проводили на круговой качалке (120-135 об/мин) при 28-30 С, Изменение содержа: ия фенола в среде культивирования контролировалось методом УФ-спектрофотометрии (максимум поглощения данного вещества 270 нм) и фотоколориметрии (реакция с 4-аминоантипирином).

Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях фенол в среде культивирования названным методом не обнару>кивэлся, Пример 3. Использование штамма

GFS-8 в качестве деструктора ацетофенона в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации ацетофенонэ заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере

2 с-тем отличием, что вместо фенола использовался ацетофенон в концентрации 1250 мг/л. Изменение содержания ацетофенона в среде культивирования контролировалось методами УФ-спектрофотометрии (максимум поглощения 245 нм) и газовой хроматографии, Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях ацетофенон в среде названными методами не определялся, Пример 4. Использование штамма

GFS-8 в качестве деструктора Q-л етилст;рола в условиях периодического культивирования на круговой качалке, 1792925

20

40

Изучение процесса утилизации а-метилстирола заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо фенола использовался а -метилстирол в концентрации 500 мг/л, Изменение содерхсания а-метилстирола в среде культивирования контролировалось методами

УФ-спектрометрии (максимум поглощения

244 нм) и газовой хроматографии.

Через 24 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях а-метилстирол в среде названными методами ца определялся.

Пример 5. Использование штамма

GFS -8 в качестве деструктора окиси мезитила в условиях периодического культивирования на круговой качалке, Изучение процесса утилизации окиси мезитила заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной излрженной в примере 2, с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода вместо фенола использовалась окись-мезитила в концентрации 1000 мг/л. Изменение содержания окиси мезитила в среде культивирования контролировалось методами УФ-спектрофотометрии (максимум поглощения 243 нм) и газовой хроматографии.

Через 96 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях окись мезитила названными методами в среде не определялась.

Пример 6. Использова::ие штамма

GFS-8 в качестве деструктора фенола и ацетофенона при их совместном содер>кании в среде в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изу .ение процесса утилизации фенола и ацетофенона при их совместном содержании в среде культивирования проводилось по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что помимо фенола 150 мг/л неагаризованная минеральная синтетическая среда М9 (состав см. пример t) содержала ацетофенон в такой же концентрации 150 мг/л. Изменение содержания обоих субстратов в среде культивирования

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas pvtida

GFS-8 ВКПМ-В-5248 — деструктор аромаконтролировалось методами УФ-спектрофотометрии (максимум поглощения; фенол

270 нм, ацетофенон 245 нм) и газовой хроматографии, Через 15 ч культивирования заявляемого штамма в указанных условиях ацетофенон названными методами не определялся, Через 19 ч ".íàëèç показал отсутствие в среде фенола.

Результаты испытания биодеструктивной активности заявляемого штамма, а также штамма-прототипа приведены в таблице.

Сравнение биодеструктивных характеристик заявляемого штамма с прототипом показываст, что штамм Pseudomonas sp QT

31 после длительной адаптации способен полностью утилизировать 1000 мг/л фенола за 36-95 ч, а заявляемый штамм разрушает ту же концентрацию фенола за 96 ч. Однако от прототипа его выгодно отличает способность деградации ацетофенона (1250 мг/л за 96 ч), а -метилстирола (500 мг/л за 24 ч), окиси мезитила (1000 мг/л за 96 ч), являющихся компонентами фенольных сточных вод.

Испытание штамма в пробах реальных сточных вод, содер>кащих фенол ацетофенон, окись мезитила, а -метилстирол показали его жизнеспособность и деструктивную активность па отношению к указанным компонентам. Присутствие достаточно высоких (350 мг/n) концентраций диметилфенилкарбинола и незначительных примесей ипериза, ацетона не снижает биодеструктивной активности заявляемого штамма по отношению к основным компонентам сточных вод.

Таким образом, предлагаемый штамм обладает высокой деструктивной активно стью, прошел испытания в образцах реальных промышленных сточных вод и может быть рекомендован для локальной очистки фенольных сточных вод от таким компонентов, как фенол, ацетофенон, а -метилстирол, окись мезитила, как по отдельности, так и при их совместном присутствии в сточных водах, тических соединений и окиси мезитила.

1792925

Составитель А,Федоров

Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 479 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5