Способ культивирования продуцента бета-экзотоксина

 

Использование: биотехнология, производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: продуцентбетаэкзотоксина штамм бактерий Вас. thurlnglensls 98-1 с культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота до стадии физиологической активности роста продуцента, в частности в течение 16 ч, затем вводят хлористый барий в количестве 0,6-0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л культуральной среды и продолжают культивирование до выхода культуры в стационарную фазу роста. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PFCI1YF JlVIK

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4780348/13 (22) 09.01.90 (46) 07.02.93. Бюл. N- 5 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Б. И, Иванов, А. А. Соломин и С. В, Катаев (56) Патент США %3087865,кл,195 — 96, 1961, (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА БЕТА-ЭКЗОТОКСИНА (57) Использование: биотехнология, производство инсектицидных препаратов. СущИзобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам производства биологических инсектицидных препаратов и может быть использовано для производства СЗР или защиты животных.

Ряд штаммов энтомопатогенного мик, роорганизма Bacillus thuringiensis(ilçëåå ВТ) в процессе их культивирования выделяют в

/ культуральную жидкость водорастворимый экзотоксин. Выход экзотоксина зависит от состава питательных сред и может быть увеличен соответствующим его подбором.

Для осаждения экзотоксина из культуральной жидкости ВТ после полного созревания спор предложен способ концентрирования экзотоксина, Для этого в фильтрат (либо в фугат) культуральной жидкости (КЖ) вносят соли бария либо кальция, связывающие экзотоксин.

Целью настоящего изобретения является увеличение выхода бета-экзотоксина

„... Ж„„1792615 А1 (sI>s А 01 N 63/00, С 12 N 1/20 ность изобретения; продуцент бета- экэотоксина штамм бактерий Вас, thurlnglensls

98-1 с культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота до стадии физиологической активности роста продуцента, в частности в течение 16 ч, затем вводят хлористый барий в количестве 0,6 — 0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л культуральной среды и продолжают культивирование до выхода культуры в стационарную фазу роста. 1 табл, сравнительно экономными средствами и уменьшение времени ферментации.

Наиболее близким к предлагаемому способу культивирования продуцента бетаэкзотоксина является способ получения битоксибациллина, заключающийся в культивировании штамма-продуцента экзотоксина на среде, содержащей источник уг- О лерода, азота в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином, В качестве последней применяют уксуснокислый кальций. Максимально достигнутый выход экзотоксина при реализации данного способа 1232-1480 ъ мг/л при расходе уксуснокислого кальция до 65 г/л (6,5 вес. 7), Поставленная нами цель — увеличение выхода бета-экзотоксина при снижении расхода солей, связывающих бета-экзотоксин в водонерастворимый комплекс, а также уменьшение продолжительности цикла ферментации достигается осаждением экзоток1792615

50 сина, выделяемого в процессе культивирования ВТ путем внесения 0,6 — 0,7 мг BaClg на 1 л К>К или 1,0-1,1 мг СаС12 на 1 л lOK o культуральную жидкость ВТ на стадии максимальной физиологической активности, Причем, если необходим препарат, содержащий только экзотоксин, процесс ферментации прекращается с выходом культуры B стационарное состояние роста, Указанные добавки образуют стойкие комплексы металл-экзотоксин и тем самым выводят последний из реакции, При этом с одной стороны, снижается ингибирующее действие экзотоксина на рост микроорганизмов ВТ, с другой — связанный экзотоксин не может расходоваться для вторичного метаболизма бактерий.

Соли бария или кальция следует вносить на 10-16 ч культивирования, что соответствует зоне максимальной скорости роста микроорганизмов, поскольку в это время максимальна и скорость накопления экзотоксина B КЖ, Наиболее предпочтительно использование cîëåé бария, поскольку степень связывания этого металла с экзотоксином на боль1иая.

11рь1ЦЕСС НаКОПЛЕНИя ЭКЗОТОКСИНа Заканчивается на стадии выхода культуры в стационарное состояние кривой роста, поэтому при получении только экзотоксинсодержащего препарата дальнейшее культивирование не требуется.

При получении смешанного экзотоксин и экзотоксинсодержащего препарата культивирование проводят исходя из степени и скорости накопления эндотоксина.

Ниже приведены примеры конкретного

ИСГ1ОЛНЕНИЯ.

П р ti м е р 1 — 14. Культивирование штамма BT 98 — 1с проводили в ферментаторе АНКУМ вЂ” 2 на среде состава: белково-витаминный концентрат (БВК) 3,6 % кукурузная мука 2,8 % соевая мука мел 0,3 % начальное значение рН среды составляло 7,2 объем среды 1,0л скорость перемешивания 400 об/мин расход воздуха на аэрацию 1 л/сек температура 30 С

Во всех вариантах условий эксперимента культивирование начинали с вывода ап-;арата АНКУМ-2 на режим, В качестве инокулята использовали смыв стерильным физраствором Объемом 30 мл с косяка куль"

45 туры ВТ-98 — 1с, прогретый в термобане при температуре 80 С в течение 5 мин, Культивирование вели с контролем температуры, рН среды, р 02 времени культивирования, Физиологическое состояние клеток контролировали микроскопированием отобранных проб, Добавки водного раствора хлористого бария или водного раствора хлористого бария или водного раствора хлористого кальция, а также продолжительность эксперимента проводили согласно схемы условий эксперимента 1 — 14.

По завершении каждой ферментации проводили анализ КЖ на содержание экзотоксина в осадке, в растворе и суммарное содержание экзотоксина. Содержание экзотоксина определяли с помощью тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии по методике (3), Погрешность измерений содержания экзотоксина составила +.0,05 г/л.

Эксперименты проводили по следующей схеме:

1. Культивирование ВТ 98 при условиях, описанных выше, время культивирования

20 ч добавки не вносились (контроль).

2, Культивирование ВТ 98 — 1с как в (1), но внесено 1,8 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бария (0,5 Mr) на 1 л КЖ через

16 ч культивирования, 3. То же, что и (1), но внесено 2,0 мл 30

%-ного водного раствора хлористого бария (0,6 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования.

4. ТО же, что и (1), но внесено 2,3 мл 30

%-ного водного раствора хлористого бария (0,7 мг) на 1 л K>l(через 16 ч культивироваIt if .

5. То же, что и (1), но внесено 1,5 мл 60

%-ного водного раствора хлористого кальция (0,9 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования, 6, То же, что и (1), но внесено 1,7 мл 60

%-ного водного раствора хлористого кальция (1,0 мг) на 1 л К>К через 16 ч культивирования, 7. То же, что и (1), но внесено 1,9 мл 60

%-ного водного раствора хлористого кальция (1,1 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования.

8. Культивирование BT 98 — 1с, что и (1) но время культивирования 48 ч (контроль).

9. 9, 10, 11, 12, 13, 14 — то же, что и 2, 3, 4, 5, 6, 7 соответственно, но время культивирования 48 ч.

Результаты экспериментов представлены в таблице.

Из таблицы следует, что содержание экзотоксина в КЖ после 20 ч культивирования превышает содержание экзотоксина в КЖ после 48 ч культивирования на 45 %.

1792615

Внесение в КЖ на 16 ч (при 20-часовом культивировании) раствора хлористого бария увеличивает содержание экзотоксина на 65, а раствора хлористого кальция — на

36 . Внесение хлоридов бария или кальция на 16 ч (при 48-часовом культивировании) также способствует увеличению выхода экзотоксина в сравнении с контролем соответственно от 72 {BaClz) до 46 7(, (CaClz) однако, в количественном отношении выход экзотоксина в этом случае ниже, чем содержание зкзотоксина, зарегистрированное при 20-часовом культивировании с внесением тех же добавок хлоридов бария или кальция, Таким образом, для достижения максимальной концентрации экэотоксина в препарате необходимо ввести указанные добавки на 16 ч от начала культивирования и закончить процесс ферментации на 20 ч.

При 48-часовой ферментации число жизнеспособных спор не зависит от введения солей металлов, содержание экзотоксина при наличии последних увеличивается примерно в 1,5 — 2 раза.

Предлагаемый нами способ культивирования продуцента бета-экзотоксина был проверен и на среде другого состава, в частности, предложенного авторами заявки, Основные компоненты среды: источники углерода, азота, лизин сохранялись согласно предложенной рецептуре, а соли, образующие с бета-экзотоксином нерастворимый комплекс, вносили не вначале ферментации, как предлагают авторы изобретения, а на стадии роста, соответствующей максимальной физиологической активности (10 — 16 ч), причем вместо уксуснокислого кальция использовались соли либо кальция, либо бария в концентрациях, предлагаемых нами в данной заявке (Примеры 15 и 16).

Пример 15. Штамм ВТ 98 — 1c выращивали на среде, обьемом 1 л, содержащей белково-витаминный концентрат (БВК) — 3 /, гидролизат кормовых дрожжей с содержанием растворимого белка 50 мг/л, гидроФормула изобретения

Способ культивирования продуцента бета-экзотоксина на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта при снижении расхода соли и времени культивирования, в

45 лизат рапсового шрота с содержанием растворимого белка 8 мг/л, лизин кристаллический (0,002 вес, ) при 30 С, аэрации 1 л/мин, скорости перемешивания 400 об/мин. На 10 — 16 ч культивирования, что соответствовало максимальной физиологической активности продуцента, внесли 2 мл

30 -ного водного раствора хлористого бария. На 20 ч процесс культивирования остановили, Содержание растворенного экзотоксина в КЖ составило; в осадке — 0,92 г/л, в растворе — 0,73 г/л, суммарно — 1,65 г/л.

Пример 16, Штамм ВТ 98 — 1c культивировали на среде того же состава, что и в примере 15, По истечении 16 ч с начала культивирования внесли 1,7 мл 60 -ного водного раствора хлористого кальция, На 20 ч культивирования содержание экзотоксина составило; в осадке — 0,9 г/л, в растворе—

0,6 г/л, суммарное количество — 1,5 г/л.

Использование предлагаемого способа получения экзотоксина в процессе культивирования ВТ обеспечивает следующие преимущества: если исчерпаны все возможности увеличения выхода экзотоксина оптимизацией состава сред на данном штамме, выход может быть увеличен еще до 70 введением раствора BaCIz (или CaClz) ориентировочно на 16 ч роста и прекращением процесса культивирования на 20 ч.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения экзотоксина обеспечивает следующие преимущества; увеличение выхода экзотоксина на 707,, уменьшение времени ферментации на 45, а также существенное уменьшение расхода солей, связывающий бета — экзотоксин в водонерастворимый комплекс, Экономический эффект от внедрения предлагаемого изобретения будет обеспечиваться увеличением выхода экзотоксина и снижением технологических затрат при ферментации, и в масштабах СССР составит не менее 700 тыс, руб. в год при уровне рентабельности ЗЗ . качестве соли используют хлористый барий в количестве 0,6 — 0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л культуральной жидкости, причем соль вводят в процессе культивирования на стадии максимальной физиологической активности роста продуцента, а процесс культивирования ведут до выхода культуры в стационарную фазу.

СОДЕРЖАНИЕ ЭКЗОТОКСИНА В КЖ В ЗАВИСИМОСТИ OT ВНЕСЕНИЯ СОЛЕЙ МЕТАЛЛОВ

Составитель Б.Иванов

Редактор -t, Hèêoëüñêàÿ Техред M.Moðãåíòàë Корректор Е.Папп

Заказ 464 Тирож Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101