Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l- продуцент моноклональных антител к антигену микобактерий человеческого типа мyсовастеriuм тuвеrсulоsis н @ rv с молекулярной массой 20 к д @
Использование: биотехнология, иммунология , медицина. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных соникатами М, tuberculosis HsvRV, с клетками мышиной миеломы линии Х63- Ад653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000 при соотношении клеток селезенки с клетками миеломы 3:1. Штамм обозначен МТ-1 и депонирован под номером ВСКК(П) 488Д. Штамм продуциру- .ет моноклональные антитела, направленные к антигену микобактерий человеческого типа мол.м. 20 кДа. Титр антител достигает в культуральной жидкости 1:256, васцитической 1:25х103. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4876728/13 (22) 20.10.90 (46) 15.02.93. Бюл. М 6 (71) Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (72) В.И.Литвинов, Л.Н.Черноусова, Н.В.Куликовская, В.Г.Вадиенко и М.А.Капина (56) Антибиотики и химиотерапия, 1988, 33, N. 5, 352, Lancet, 1981, 25, 7, 167. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК Mus musculus — ПРОДУЦЕНТ
МОНОКЛОНАЛЬ Н ЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ МИКОБАКТЕРИЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО
ТИПА Mycobacterlum tuberculosis H37 RV С
МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 20 кДа
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, Изобретение описывает получение и свойства гибридного клона MT-1 — перевиваемых мышиных клеток (гибридома), продуцирующих моноклональные антитела к микобактериям человеческого типа М tuberculosis Нз7ЯЧ.
Получение укаэанного продуцента открываетт перспективы усовершенствования методов серодиагностики туберкулеза, а именно определение противотурбекулезных антител и антигенов микобактерий туберкулеза в сыворотках и других биологических жидкостях человека методами иммуноферментного анализа, радиоиммунологического и иммунофлюоресцентного анализа.
Имеются многочисленные данные по получению гибридом, продуцирующих .моноклональные антитела к бактериям. Одна„„ЯЦ„„1794949 А1 (57) Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущносгь изобретения . штамм получают путем слияния спленоцитов мышей BALB/c, иммунизированных соникатами М, tuberсо!0$! $ H37RV, с клетками мышиной миеломы линии Х63—
А9653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000 при соотношении клеток селезенки с клетками миеломы 3:1.
Штамм обозначен MT-1 и депонирован под номером ВСКК (П) 488Д. Штамм продуциру.ет моноклональные антитела, направленные к антигену микобактерий человеческого типа мол.м. 20 кДа. Титр антител достигает в культуральной жидкости 1;256, в асцитической 1:25х10 . 1 табл, ко представленное изобретение отличается тем, что полученная гибридома MT-1 продуцирует моноклональные антитела (МкАт) к
М tuberculosis Hg7RV, Получены MKAT к микобактериям туберкулеза человеческого типа. Штамм-аналог отличается от заявляемого штамма специфичностью: направленностью к другой антигенной детерминанте, а именно в 20 кДа.
Цель изобретения — получение МкАт, специфически реагирующих с микобактериями человеческого типа М tuberculosis
Н37ВЧ.
Цель достигается созданием штамма гибридных клеток путем слияния клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, иммунизированных соникатом М tub, Hz7RV, способных к росту в мышах в виде асцитной опухоли и к продуцированию и асцитную жидкость в высоком титре моно1794949 клональных антител к антигену микобактерий человеческого типа (M.tuberculosis
Н 37RQ
Штамм клеток MT-1 депонирован во
Всесоюзной коллекции клеточных культур
Института цитологии АН СССР в г. Ленинграде под М.
Способ получения штамма. Мышей линии BALB/с иммунизировали подкожно в 6 точек 100 мкг сониката МАнЬ, Нз7ЯЧ в неполном адьюванте Фрейда двукратно, с интервалом в 2 недели. Бустерную дозу 40 мкг сониката вводили внутривенно за три.дня до забора клеток селезенки для гибридизации, Титр антител, специфических к соникату Нз7ЙЧ в сыворотке крови иммунной мыши, определялся методом иммуноферментного анализа с антигенами, которыми иммунизировали, и составлял 1:16 тысяч, Слияние спленоцитов с клетками мышиной миеломы линии X63 — Ag8653 осуществляли с помощью 50% раствора ПЭГ(полиэтиленгликоль) 6000 (Merck) при-соотношении кле.ток селезенки с клетками миеломы 3. 1.
После процедуры слияния клетки суспендировали в селективной среде ГАТ из расчета .Зх10 клеток/лунку 96-луночной панели. Че4, рез 7 дней после гибридизации панели просматривали с помощь инвертированного микроскопа, Рост гибридных клонов отмечался в 80 лунок. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) через 14-17 дней тестировали культуральную жидкость из лунок с растущими клонами на присутствие специфических антител, Для отбора гибридных клонов ИФА использовали набор антигенов-соникатов из МЛЕТЬ. НзтВЧ, BCG, Intracelluiare, Scrofulaceum, Fortuitum u
Е.coll, Кул ьтуральные характеристики линии.
Среда для культивирования: среда
RPM1-1640 с 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ
НЕРЕ S-буфера, 2 мМ 1=глутамина, 5 10 М
2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл гентамицина, Характер роста: стационарная суспензия
Метод снятия; встряхивание
Частота пассирования:2-3 суток
Посевная доза: 2-3 10 клеток/мл
Кратность рассева: 1;2-1:3
Консервация клеток: клетки заморожены после 1,3. 10, 15 и 25 гессажей в культуре и после роста в виде асцитной опухоли в мышах, Общее количество ампул — 30, по
4-5 млн клеток в ампуле, Криозащитная среда: эмбриональная телячья сыворотка с 1020% диметилсульфоксида, Режим замораживания: клетки в криозащитной среде хранили 1-3 сут при -70 С, после чего помещали в жидкий азот. Выживаемость при размораживании — 80, 5 Сведения о контаминантах линии: бактерии — нет,грибы — нет,микоплаэма — нет, дрожжи — нет, Морфология культуры; культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату кле10 ток с обычной для гибридных антителообразующих клеток морфологией (округлые клетки с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы, ядрышки крупные, по 1-2 в ядре).
15 Кариология культуры: кариотип соответствует виду Mus.muscutus, Модальное число хромосом-89, интервал изменчивости от 78 до 92 хромосом.
Пример 1. Культивирование гибрид20 ных клеток in vitro при посадочной концентрации 200 тыс,кл/мл ростовой среды, культура клеток инкубируется 2-3 сут в стационарном состоянии при 37 С в атмосфере
5% СО2, Концентрация клеток, превышая 1
25 млн/мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их гибель. Культуральную жидкость из флакона с 3-дневной культурой тестируют на присутствии моноклональных антител, 30
Пример 2. Культивирование гибридомных клеток in vlvo: культивируемые in
vitro клетки при концентрации, не превышающей 500 тыс/мл, т,е. находящиеся в логарифмической фазе роста, центрифугируют
10 при 200g, Осадок клеток после центрифугирования суспендируют и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего, 5 — 7 млн клеток/мл вводят в брюшную полость мышей BALB/c, предварительно обработанных и ристаном, Обработку проводят однократно за 1-3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекций 0,5 мл пристана. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуются асцитные опухоли. Количество асцитной жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей, в среднем составляет 5 мл.
Пример 3, Активность и специфичность моноклональных антител в ИФА. Для осуществления иммунохимической характеристики полученных МкАт из супернатантов культуры гибридомы МТ-1 и асцитной жидкости была выделена глобулиновая фракция высаливанием (МН4)2$04 при 50 насыщении. В глобулиновой фракции определяли количество белка спектрофотометрически при длине волны 260 и 280 нм (при разведении глобулина в 50 раз).
1794949
На основании выполненного анализа было показано, что МкАт MT-1 на высоком уровне связывались с соникатом
М tuberculosis НзтКЧ, тогда как соникатом
M. BCG реакция была более слабая, а с остальными соникатами связывание было на уровне фона реакции.
20 гену микобактерий человеческого типа
Mycobacterlum tuberculosis НзтЯЧ с мол,м, 20 кДа.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК {П) N 488Д— продуцент моноклональных антител к антиХарактеристика специфичности МкАт Мт-I в реакции с соникатами микобактерий в ИФА
Составитель Г, Борискина
Редактор В. Трубченко Техред М.Моргентал Корректор Т, Палий
Заказ 407 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101
Характеристику специфичности полученных МкАт проводили с помощью ИФА.
Для анализа использовали тот же набор антигенов-соникатов, на которых проводили скрининг супернатантов при отборе клонов, Концентрация антигенов была 10 мкг/мл. 5
Глобулиновую фракцию МкАт использовали в следующих концентрациях; 10, 2,5, 1,25, 0,625 мкг/мл. На сенсибилизированный антигенами и заблокированный 1;/, бычьего сывороточного альбумина планшет наноси- 10 ли по 25 мкл глобулинов МкАт в трипликатах для каждого антигена. Реакцию проявляли
"вторыми" антителами против иммуноглобулинов мыши, меченными пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали 15
307 НгОг и сртофенилендиамин. Средние показатели оптической плотности трипликатов при длине волны 492 нм представлены в таблице.
Использование полученных антител позволит повысить эффективность диагностики туберкулеза за счет увеличения специфичности иммунологических реакций при определении противотуберкулезных антител и антигенов микобактерий человеческого типа у больных туберкулезом, а также даст возможность раннего выявления инфицирования микобактериями туберкулеза при профилактическом обследовании людей.
