Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой формам н-антигена человека

 

Использование: биотехнология, медикобиологические исследования и судебно-медицинская экспертиза. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) повышенной чувствительности по отношению к Н-антигену человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей (ДВА/2хВа lb/c)FI с клетками миеломы РЗ-ХбЗ-Ад.8.653.МКА относятся к Ig класса М. Их титр в культуральной жидкости, определяемый в Микропанельной реакции агглютинации с эритроцитами группы О, составляет 1:256-1:512, в асцитной - 1:256000. Полученные МКА способны взаимодействовать как с мембраносвязанной, так и растворимой формами Н-антигена человека . 2 табл. . ел с

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4915082/13 (22) 28.02.91 (46) 30.01.93, Бюл. М 4 (7t) Всесрюзный гематологический научный це нтр C (72) А.Е,Носырев, Е.В.Белкина, Е.И.Дерюгина. М,И.Лапенков, А,А.Недорезов, Н.И.Оловникова, Г,А.Удалов, Н.Б.Чекнева и И.Л.Чертков (56) Авторское свидетельство СССР

Й . 1551737, кл. С 12 N 5/00, 1988. (54) ШТАММ ГИБРИДНЪ|Х КУЛЬТИВИРУЕMbIX КЛЕТОК MUS MUSCULUS „ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ, МОНОКЛОНАЛЬHblX АНТИТЕЛ К MEMБРАНОСВЯЗАННОЙ И РАСТВОРИМОЙ

ФОРМАМ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для,выявленйя Н-антигена на поверхности эритроцитов человека и его растворимой формы. в слюне лиц — выделителей, Известен штамм Н вЂ” 86/44, продуциру ющий моноклональные антитела (MKA) к мембраносвязанной и растворимой формам

Н-антигена человека.

Однако данные антитела обладают не.достаточной специфичностью и чувствительностью. целью изобретения является получение гидридомы, продуцирующей МКА к мембраносвязанной и растворимой формам Н-антигена человека, обладающие повышенной чувствительностью.

Штамм получают следующим образом, „„5Ц „„1791453 А1

<5»s С 12 N 5/00, С 12 P 21/08 (57) Использование: биотехнология, медикобиологические исследования и судебно-медицинская экспертиза. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (МКА) повышенной чувствительности по отношению к Н-антигейу человека, Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей (ДВА/2хВа Ib/ñ)FI с клетками миеломы

РЗ-Х63-Ag.8,653,МКА относятся к Ig класса

М, Их титр в культуральной жидкости, определяемый в микропанельной реакции агг-" лютинации с эритроцитами группы О, составляет 1:256 — 1:512, в асцитной—

1:256000. Полученные MKA способны взаи модействовать как с мембраносвязанной, так и растворимой формами H-антигена человека, 2 табл.

Самок мышей ДВА/2 х Ва(В/cF1 воз- д раста 6 нед, иммунизйруют пятикратно отмытыми эритроцитами группы О, полученными от нескольких доноров. Первую иммунизацию проводят 50 -ной сусЪ пензией эритроцитов в физрастворе и Ф полном адьюванте Фрейнда (0,3 мл внутри- (Я брюшинно и 0,2 мл подкожно). Вторую им- (p3 мунизацию осуществляют через 2 нед. внутривенно 3 -ной взвесью эритроцитов лпо 0,25 мл/мышь. Через 2 сут. после бус- > терной иммунизации спленоциты 5 иммунных мышей гибридизуют с клетками миеломы мыши Р3-Х63 Ag8.653, рассеянной за сутки до этого в концентрации О,45 х 10 кл/мл.

Перед гибридизацией клеточные суспензии трижды отмывают в бессывороточной среде.

1791453

Слияние проводят в 50-мл конических пробирках в присутствии 40 -ного полиэтиленгликоля (мол.масса 3000-3700) в среде DMEM С 15 0МСО в течение 1 мин (300 х 10 спленоцитов и 150 х 10 клеток миело-:

6 мы).

Затем в течение 4 мин к клеточной суспензии добавляют 5 мл бессывороточной среды ОМЕМ, а затем доводят объем суспензии до 50 мл средой, РМЕМ с 2ь эмб; риональной телячьей сйворотки (ЭТС).

Клеточную суспензию центрифугируют 8 мин при 800 o6/мин, осадок ресуспендируют в полной питательной среде в концентрации 1х10 кл/мл и клетки помещают В

96-ячеечные плоскодонные платы в объеме

0,2 мл (2 х 10 клеток) на ячейку.

Гибридные клетки культивируют в полной питательной среде ДМЕМ с добавлением антибиотиков, 4 мМ глутамина, 20 мМ

Хепес-буфера, 1 мМ пирувата натрия, 5 х х10 М 2-меркаптоэтанола и 10 — 20 ЭТС.

Селекцию клонов проводят на среде

ГАТ (2ь 50 — кратного концентрата в течение 7 сут после слияния). Через 1 нед. при смене половины объема среды вместо

ГАТ добавляют 27 50-кратного концентрата ГТ (среды, содержащей гуанин и тимидин).

Скрининг моноклокальных антител (МКА) проводят на 11 — 18 сут. после слияния методами агглютинации и иммуноферментного анализа. В результате тестирования отбирают гибридому Н вЂ” 89/8, продуцирующую МКА к Н вЂ” антигену на поверхности эритроцитов человека и его растворимой форме. Гибридому клонируют дважды, эффективность клонирования 92 .

Штамм Н вЂ” 89/9 характеризуется следующими признаками, Культуральны е свойства.

Среда культивирования: ДМЕМ с добавлением 3 мм L глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 20 мМ Хепес — буфера, 5 х 10

М 2 — меркаптоэтанола, 10 ЭТС или оленьей сыворотки и антибиотиков. Частота пассирования 1:2 — 1:3 через 2-3 сут. плотность клеток в жидкой среде 3-4 х 10 кл/мл.

Клетки выращивают при 37 С, 67-ном содержании COz в воздухе и 95 — 100 -ной влажности. При культивировании in vlvo

Мышам линии ВА1 В/с внутрибрюшинно за

7-30 сут. до введения гибридных клеток вводят пристан (0,25 мл), Гибридные клетки инъецируют в количестве 2-3 х 10 /мышь, 6 асцитные опухоли образуются через 12-16 сут, Морфологические признаки.

Слабоприкрепленные к субстрату клетки с обычной для гибридом морфологией.

20 среда:

30

40 ного донора

5

Кариологические признаки. Маркерные хромосомы:

1 субтелоцечтрическая и I метацентрическая.

Модельное число хромосом 92 (86-94).

Характеристика полезного продукта:

MKA ОтнОсЯтсЯ к ig М; Они ВыЯВлЯют H-антиген на поверхности эритроцитов человека, а также его растворимую форму в слюне лиц — выделителей.

Продуктивность штамма. Титр MKA в культуральной жидкости составляет 1:256—

1;512, в асцитной — 1:256х 10з.

Стабильность продуктивных свойств сохраняется в течение l5 пассажей.

Контроль контаминации. Бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены. Тестирование на вирусы на проводилось.

Режим замораживания. Криозащитная

10 (ДМСО, 40 любой сыворотки, ростовая среда.

Клетки выдерживают в течение суток при — 70 С. затем переносят в жидкий азот.

Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-65 .

Использование штамма H — 89/8 иллюстрируется следующими примерами;

Il р и м е р 1. Проводят оценку серологических свойств супернатанта, содержащеro М КА, в отношении эритроцитов различных групп крови системы АВО, для которых характерно снижение содержания

Н вЂ” антигена в ряду О-В-А1-А1В. Двойные разведения MKA на фосфатно — солевом буфере или 0,9%-ном NaCI в объеме 50 мкл вносят в ячейки 96 — луночной круглодонной платы и смешивают с равным объемом 2 ной взвеси эритроцитов, полученных от одЧерез 30-60 мин инкубации при комнатной температуре определяют титр антител.

За титр МКА принимают последнее разведение, дающее видимую реакцию агглютинации. Результаты исследований представлены в табл.1, Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что титр полученных

МКА в реакции агглютинации с эритроцитами группы А18 более чем в 100 раз ниже, чем с эритроцитами группы О. Это доказывает отличие антител Н вЂ” 89/8 от известных (Н вЂ” 86/44), а также их способность взаимодействовать с мембраносвязанной формой

Н вЂ” антигена, практически не дискриминируя эритроциты различных групп крови системы АВО, Пример 2. Образцы культуральной среды, содержащей МКА, разводят в 2 раза фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) с до1791453

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК(И) hk 461, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной и растворимой.формам Н-антигена человека.

Таблица 1

Таблица 2

Составитель M. Серова

Редактор С. Кулакова Техред M.Моргентал Корректор С.Патрушева

Заказ 134 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 бавлением 0,3 Твина-20. На нитроцеллюлозную мембрану наносят разведенную в

100 раз трис-глициновым буфером слюну лиц — выделителей различных групп крови системы АВО. Кусочки мембраны помещают 5 в лунки 96 — ячеечной плоскодонной платы и инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре на ротационном шейкере с образцами МКА в количестве 100 мл, Затем мембрану отмывают в 200 мкл фосфатно-со- 10 левого буфера с 0,3 Твина-20 3 раза по 10 мин.

Далее мембрану инкубируют в течение

1,5 ч при комнатной температуре с разведенной в 500 раз антиглобулиновой сыво- 15 роткой, меченной перексидазой. После инкубации мембрану отмывают еще 3 раза по 10 мин 200 мкл фосфатно-солевого буфера с Твином-20.

Пероксидазную активность выявляют в 20 растворе субстрата (4 — хлор — 1 — нафтола) в течение 30 мин при комнатной температуре. Результаты исследований представлены в табл.2.

Результаты, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что активность полученных антител Н вЂ” 89/8 в иммуноферментном анализе максимальна с антигеном, содержащимся в слюне лиц — выделителей группы крови O.

Таким образом, данные антитела способны выявить Н-антиген в растворимой форме и могут быть использованы как ценный реагент в судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств.