Способ культивирования тканей in viтrо

 

Область использования: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: кусочки ткани диаметром 1-1,5 мм в стерильных условиях помещают между двумя предметными стеклами, покрытыми слоем желатины в качестве подложки, после чего погружают вертикально в пластмассовые кассеты с питательной средой Игла. Питательная среда Игла дополнительно содержит поливинилпирролидон для инактивации продуктов жизнедеятельности клеток. Культивирование проводят в течение 4-5 дн без смены среды.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00, 5/02

ГОСУДАРСТВЕ ННОЕ ПАТЕ НТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

° ю »»

«4

О

° евай <

Ф

Сл

ЬЭ

1 (21) 4903898/13 (22) 22,01.91 (46) 30.01.93, Бюл. М 4 (71) Воронежский государственный медицинский институт им.Н,H.Áóðäåíêî (72) Л.А.<Ьилиппова и А.Л.Лавренов (56) С,С.Акопьянц в кн. Актуальные вопросы . современной онкологии, вып,6, I980, изд-во

M ГУ.

Чеботарев В.В. Лабораторное дело, 1980, М 7, с.445. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТКА НЕЙ In vitro

Изобретение относится к области медико-биологических исследований. . Существуют различные методики получения тканей.

1) в чашках Петри на питательной среде

С подложкой

2) в пробирках с питательной средой

3) во флаконах Карреля (1).

Однако эти методы имеют ряд недостатков: 1) производится исследование неокрашенных культур под микроскопом на стекле пробирки или в чашке Петри, это ограничивает сферу использования данных методов, лишает большого объема информации, который становится доступным при исследовании окрашенных препаратов на основе достижений гистологической техники, 2) использование нестандартных узких стекол, помещаемых в пробирку для культивирования ткани, также создает большие неудобства, т,к. посуда для окраски препаратов, покровные стекла, предметный столик микроскопа в препаратоводитель рассчитаны

„„5U,, 179!452" А1 (57) Область использования: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: кусочки ткани диаметром 1-1,5 мм в стерильных условиях помещают между двумя и редметными стеклами, покрытыми слоем желатины в качестве подложки; после чего погружают вертикально в пластмассовые кассеты с питательной средой Игла. Питательная среда

Игла дополнительно содержит поливинилпирролидон для инэктивации прОдуктОВ жизнедеятельности клеток. Культивирование проводят в течение 4-5 дн без смены среды. на стандартные предметные стекла, 3) при всех методах, перечисленных выше, отмечается низкий выхода культур — 45, Известен способ культивирования на стандартных предметных стеклах с последующим микроскопическим исследованйем (2J, Автор предложил в пенициллиновый флакон помещать суспензию клеток в культуре, накрывать флакон предметным стеклом, которое с помощью зажима и кольцевидной прокладки прижимается герметически к флакону, затем флакон переворачивается, клетки из суспензии под действием силы тяжести опускаются на предметное стекло, где образуют культуру.

По окончании культивирования культивационную камеру разбирают, предметное стекло с культурой подвергают микроскопическому исследованию.Недостатком метода является:

1) Необходимость получения клеточной суспензии, что усложняет процесс культйвирования.

1791452

2. Введение каких-то веществ в такую камеру затруднительно, т.к. для этого необходимо перевернуть камеру с культурой на стекле на 180, раэгерметизировать систему и привести культуру на некоторое время в соприкосновение с воздухом, что резко нарушит постоянство среды и условия стерильности. ,. 3. Малые размеры культивационной каприводят к накоплению продуктов жизнедеятельности клеток, что изменяет рН и ограничивает сроки культивйрования.

Цель изобретения — упрощение способа

15 культивирования ткани с высоким выходом культур.

Указанная цель достигается тем, что фрагменты ткани диаметром 1-1,5 мм в стерильных условиях помещаются на предмет20 ное стекло, покрытое желатином в качестве подложки, и накрываются вторым предметным стеклом. Полученные пары стекол помещаются вертикально в специально изготовленные пластинчатые кассеты из хи25 мически инертного материала с прорезями для сдвоенных стекол, Кассета заполняется культивационной средой так, чтобы покрыть кусочки, хотя по законам каппилярности среда поднимается выше и заполняет все пространство между стеклами. Испольэова30 ние для выращивания монослоя клеток пространства между двумя предметными стеклами увеличивает площадь поверхности роста, поддерживает постоянство среды между стеклами. Кассеты со сдвоенными

35 стеклами в культуральной среде помещают в сухие стерильные банки 0,5 литра, которые сверху покрывают стерильными чашками Петри. Полученные культивационные камеры ставили в термостат при 37 С, где

40 процесс культивирования продолжался 4—

5 дней. При необходимости более длительных сроков культивирования с помощью стерильного шприца производили замену среды.

Пример. Больному С., 64 лет, произведена операция нефректомии по поводу рака левой почки..После визуального исследования удаленной опухоли стерильным скальпелем в операционной иссекали 1-2 кусочка опухолевой ткани 1 х 1 х 0,5 см, 50 -помещали в стерильный флакон с питательной средой Игла с добавлением антибиотиков (по 100 ЕД на 1 мл пенициллина + стрептомицина). Флакон закрывали рези55 новой пробкой и доставляли в лабораторию

Все дальнейшие работы производились в стерильных условиях: в боксе кусочки опухоли в чашке Петри с небольшим количеством культуральной среды измельчали на меры в системе В.В.Чеботарева быстро. 10 фрагменты по 1 — 2 мм, три кды промывали культуральной средой, затем в течение 5 обрабатывали 0,25% раствором трипсина при 37ОС для лучшего разъединения клеток.

Затем по 1 — 2 кусочка опухоли высаживали на предметные стекла, покрытие 10% раствором желатина в качестве подложки. Каждое стекло с фрагментом опухоли накрывали другим сухим стерильным стеклом и погружали в кассету с культуральной средой, в которую кроме питательной среды

Игла. входили сыворотка крупного рогатого скота. стандартная сыворотка крови человека, стимуляторы роста (витамины, кортикостероиды, инсулин, феррум — лек, а также поливинил-пирромидон для инактивации продуктов жизнедеятельности клеток при культивировании, антибиотики. Приводим состав культуральной среды: среда Игла — 80 об/проц

- сь вороткэ крупного рогатого скота — 17 об/проц стандартная сыворотка крови человека — 3 об/проц

2 ЕД/мл

1 мкг/мл

0,2 мкг/мл

1 мкг/мл

0,1 мкг/мл

01 ЕД /мл

+А

+Е

+В12

+К преднизолон инсулин поливинилпирролидон: 0,1 мг!мл пенициллин 100 ЕД/мл стрептомицин 100.ЕД/мл

Кассета вкладывалась в сухую стерильную стеклянную банку 0,5 л, которая накрывалась стерильной чашкой Петри, что вместе составляло культивационную камеру. На 5 сутки культивирования среду сливали, культуры фиксировали 10% нейтральным формалином, пары стекол разбирали, маркировали препараты, окрашивали гематоксилин-эозином, заключали в полистирол и накрывали покровными стеклами. При исследовании под световым микроскопом была видна переживающая ткань эксплэнтэта иэ которого на предметное стекло выселялись клетки. образуя зону роста в вйде монослоя вокруг эксплантата.

Среди клеток, формирующих монослой, преобладали эпителиальные опухолевые клетки с признаками структурного атинизма, патологическими митоээми. В некоторых случаях опухолевые клеткй росли в виде сферических колоний. Образования более дифференцированных структур (сосочков, желез, трубочек) в указанные сроки культивирования мы не наблюдали.

1791452

Составитель Л. Филлипова

Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева

Редактор С. Кулакова

Заказ 134 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб.. 4/S

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Преимущества данного способа культивирования состоят в следующем:

1. Способ обеспечивает высокий выхода культур опухолей человека (81-97®, которые обычно культивируются с большим трудом, выхода культур при других способах культивирования in vitro колеблется от

41 до 45g,, 2. Наш способ единственный, в котором предложено культивирование клеток в узком пространстве между двумя предметными стеклами; при этом питательная среда поступает к клеткам по законам капиллярных сосудов, что приводит к более плавному изменению среды культивирования при введении в нее каких-то дополнительных веществ, отсутствует травматизация культур при смене среды.

2. Способ дает возможность получить рост культуры клеток не только из суспензии, но при высаживэнии на предметное стекло кусочков опухоли диаметром 1 — 2 мм, .что значительно упрощает метод.

4. Преимуществом является доступность и дешевизна метода, не требующего специального оборудования: а) использование стандартных предметных стекол, б) легкость приготовления кассеты для культивирования (использование любых мягких пластмассовых коробочек, в которых проделываются прорези для стекол в) в отличие от других авторов мы ввели в культуральную среду поливинил-пирролидон, который благодаря инактивации токсических продуктов, способствует поддержанию рН на постоянном уровне. Это позволяет обойтись без продувания через среду газовой смеси постоян нога состава, что так5 же упрощает и удешевляет метод.

5. Мы продемонстрировали возможность использования культуры клеток, полученным нашим способом для изучения различными гистологическими, гистохими10 ческими, эвторадиографическими методами. Предложенный нами способ культивирования ткани IA vltlо может применяться при исследовании различных научных проблем, таких как рост, 15 пролиферация, старение клеток, взаимодействие эпителия и стромы, канцерогенез, скрининг лекарственных препараТоа, а так же в практическом здравоохранении для исследования индивидуальной

20 химикочувствительности опухолей конкрет. ных больных.

Формула изобретения

Способ культивирования тканей in vitro, включающий помещение клеточного мате25 риала нэ предметное стекло с последующей инкубацией в питательной среде, о т л и ч аю шийся тем, что. с целью увеличения выхода клеток, в качестве клеточного мате-. риала используют зксплантанты тканей, ко30 торые покрывают предметным стеклом, погружают в вертикальном положенйи в кассеты с питательной средой, дополнительно содержащей поливинил —. пирролидон в концентрации 0,1 мг/мл. после чего

35 помещают в стерильные емкости.