Штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота

 

Использование: биотехнология, вирусология, ветеринария. Сущность изобретения: линию клеток легкого эмбриона коровы, хронически инфицированную вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получают путем сокультивирования клеток легкого эмбриона коровы с лейкоцитами инфицированной ВЛКРС и большой лейкозом коровы . Клеточная обозначена ЛЭК- ВИЭВ-90 и депонирована под номером ВСКК (СХК) 1. Линия клеток репродуцируется на отечественных средах с добавлением коммерческой сыворотки крупного рог атого скота. „ч

Ф"

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СО ЦИАЛ И СТИЧ ЕС КИХ

РЕСПУБЛИК (l 9) (1 () (g()g С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4884320/13 (22) 23.11 ° 90 (46) 30.11.92. Бюл. 1" 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Êîâàëåíêî (72) t1. И. Гулюкин „Н. В. Замараева, Л.П.Дьяконов, Д.В.Лобунцова, А.В.Васин, ll.А.Иванова, В,П.Нишков и Л.Г.Бурба (56) N. T.Van der Haaten, f.È.È 11ед..

А.D.Boothe. Иа(-.. Cancer, Inst. 1974, 52 491 - 497.

Авторское свидетельство СССР

1" 702073, кл. С 12 К 9/00, 1978. (54) ЫТАМИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ЛЕГКОГО ЭМБРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАПРОДУЦЕНТ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РО-.

ГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к получению штамма перевиваемых клетокпродуцента вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), используемого для размножения ВЛКРС, а также для приготовления антигенов ВЛКРС для серологических реакций и для специфи-, ческой профилактики ВЛКРС-инфекции.

Цель изобретения - получение штамма перевиваемых клеток, хронически инфицированного отечественным штам-..: мом ВЛКРС, интенсивно продуцирующего

ВЛКРС и его антигены и обладающего способностью хорошо репродуцироваться на отечественных средах с коммерчес(57) Использование: биотехнология, вирусология, ветеринария. Сущность изобретения: линию клеток легкого, эмбриона коровы, хронически инфицированную вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получают путем сокультивирования клеток легкого эмбриона коровы с лейкоцитами инфицированной BllKPC и большой лейкозом коровы; Клеточная л)(ния обозначена ЛЭК ВИЭВ-90 и депонирована под номером

ВСКК (CX)() 41. Линия клеток репродуцируется на отечественных средах с добавлением коммерческой сыворотки крупного рогатого скота. аЪ кой сывор эткой крупного рогатого ско. та.

Цель достигнута благодаря получению нового штамма перевиваемых клеток легкого эмбриона КРС (ЛЭК-ВИЭВ-90), продуцента ВЛКРС.

Полученный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки з

: ЛЭК-ВИЭВ-90 растут на поверхности стекла в виде однослойной культуры.

По морфологии клетки штамма однород: ные фибробластоподобные, отросчатые вытянутой формы. Ядро у них овальной формы, расположено эксцентрично, содержит 2-4 ядрышка округлой формы. В

1778185 популяции преобладают клетки с диплоидным набором хромосом. физиологические признаки. Клетки штамма растут в виде монослоя B среде фГМ-С с добавлением 101 сыворотки крупного рогатого скота, не содержащей антител к ВЛКРС. Оптимальная плотность посева составляет 2х 10 клеток/мл. Монослой формируется 1п на 3-4 сутки. С поверхности стекла клетки снимаются 0,023 раствором Версена, индекс пересева составляет 1:5.

Птамм клеток не контаминирован микоплазмами и цитопатогенными вируса- 15 ми.

Ытамм клеток легкого эмбриона коровы ВИЭВ-90, хронически инфицированный ВЛКРС, получен путем сокультивирования первичнотрипсинизированной 2п культуры клеток легкого эмбриона ко- ровы (2 пассаж) с лимфоцитами крови инфицированной BJlKPC и больной лейкозом коровы (диагноз гистологически. подтвержден). Соотношение клеток лег-25 кого эмбриона коровы и лимфоцитов крови составляло 1:2, время адсорбции

36-М часов, температура 36,5-37,5 С

Пример. Клетки штамма культивируются в стеклянных матрасах при Эп температуре 37,0 С в питательно" среде, состоящей .из среды бГМ-С, 101 сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед/л). Оптимальная плотность посадки клеток штамма составляет 2 10 клеток на 1 мл среды.

Монослой формируется через 3-4 суток.

При пересеве клетки с поверхности стекла снимают подогретым до 37 С

0,023 раствором Версена.

Коэффициент пересева равен 1;5.

Клетки штамма продуцируют в питательную среду ВЛКРС и его антигены.

Продуцируемый клетками штамма вирус . идентичен исходному вирусу, использованному для заражения клеток. Под электронным микроскопом продуцируемый клетками ЛЭК-ВИЭВ-90.вирус имеет типичную для вирусной частицы типа

"С" морфологию, т.е. состоит из центрально расположенного электронноплотного нуклеотида диаметром 6090 нм, между нуклеотидом и двухслой" ной внешней мембраной вириона располагается электронно-прозрачная проме- 55 жуточная зона.

Размер зрелого вириона составляет

80-120 нм.

Продукция ВЛКРС этим штаммом выявляется с помощью реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (ГИД) с использованием тест-системы для идентификации антигенов ВЛКРС (сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену вирусной оболочки ВЛКРС (qp51), сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к протеидному антигену ВЛКРС (р24), коммерческий антиген ВЛКРС, содержащий qp51 и р24.

Число пассажей в течение которых штамм сохраняет вирус-продуцирующую способность равно. 30, продукция вируса штаммом клеток колеблется от 4 10 до 1 10 вирионов на 1 мл среды.

Для практического использования в

РИД, слитую на 5-6 день культуральную жидкость (КИ), содержащую вирус и его антигены, концентрируют.

Для этого к К)(добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ6000) до конечной концентрации 203 и хлорид натрия до конечной концентрации 0,5 М и, после их растворения, инкбировали в течение

1б часов при 4,0 С. Затем образовавшийся преципитат отделяли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение

30 мин. Надосадочную жидкость декантировали, з осадок ресуспендировали в

0,05 М трис НС1-буфере (рН 7,2-7,4).

Полученную жидкость осветляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин. Полученная в результате этого жидкость содержала растворимые антигены ВЛКРС и использовалась в

РИД. Соотношение начального (КИ) и . конечного объемов (надосадочная жидкость после второго центрифугирова- . ния) было 10:1. Один мл. полученного концентрата содержал 50 доз антигена, используемого в РИД.

Предложенный штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота ВССК (СХ)<) 1Г 41 - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота депонирован в коллекции диплоидных культур Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р,Коваленко, ВАСХНИЛ, r.éoñêaà, под Р 41.

Предложенный штамм клеток обладает следующими преимуществами: являясь штаммом перевиваемых хронически инфицированной ВЛКРС клеток, он способен долго, не вырождаясь, интенсивно продуцировать- отечественный

Отамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота

ВСКК (СХН) 1. 41 - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Составитель В.Свиридова

Техред И.Иоргентал

М

Редактор Л.Павлова

Корректор . С, Юско

Заказ 4165 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 1778185 б штамм вируса лейкоза крупного рогато- ровом геле, котор " служит дл"

rn скота и его антигены, ления животных, инфицированных ВЛКРС. штамм клеток способен репродуциро- Итамм перевиваемых клеток ЛЭКваться на отечественных средах ко- . ВИЗВ-90 может быть использован для

Э

6 торые изготовляются без использования биофабричного производства антигенов компонентов, не производящихся в на- ВЛКРС. шей стране, с добавлением коммерческой сыворотки крупного рогатого ско- формула изобретения та.

Сконцентрированная в 10 раз культуральная жидкость ЛЭК-ВИЭВ-90 может быть использована в качестве антигенов BJlKPC, используемых в РИД в ага