Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к антигену 8 возбудителя мелиоидоза рsеudомоnаs рsеudомаllеi

 

Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения: штамм получают путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653. Штамм ВСКК(Н) 276 Д депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночника Института цитологии АН СССР. Продуцирует моноклональные антитела , относящиеся к иммуноглрбулинам класса М (IgM), специфически направленные к антигену 8. Титр иммуноглобулинов в ИФА в культуральной жидкости до 40, а асцитной жидкости до 106, титр антител в асцитной жидкости в непрямом иммуноофлюоресцентном анализе до 103. Стабильность антителопродукции штамма сохраняется на протяжении 50-52 пассажей в культуре и 5 пассажей на животных (срок наблюдения).

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ6ЛИК (я)з С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ } (21) 4864957/13 (22) 29.06.90 (46) 30.01.93. Бюл, N 4 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И,Мечникова и

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72) В.В.Свиридов, И.В.Синюкова, Л,Э.Луговая, А.В.Липницкий, Н.П.Храпова, А.M.Áàðков и С.М.Фарбер (56) Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Антигенная структура Pseudomonas pseudomal}ei.

Ж МЭИ, 1981, N. 4, с.78. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК Mus MuSCuLuS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНО КЛ О НАЛ Ь Н Ь}Х АНТИТЕЛ К

АНТИГЕНУ 8 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДО3А PSEUDOM0NAS PSEUD0MALLEI (57) Использование: биотехнология, иммуйология. Сущность изобретения: штамм

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения моноклональных антител (МкАТ) против антигена мелиоидоза, применяемых для определения

Ps-pseUdomaI}el в реакциях иммунофлюоресценции и преципитации в геле.

Для дифференцирования возбудителей, относящихся к роду Psudomonas, используют набор тестов, основанный на сравнении биотехнических и культуральных свойств микроорганизмов, Наряду с этим длительным и трудоемким методом применяют также более быстрые серологические методы дифференциации пСевдомонад при помощи поликлонал ьн ых антисы вороток.

Однако, при применении таких сывороток

„„5Q „„1791450 А1 получают путем слияния клеток селезенки мышей BALB/ñ, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя мелиоидоза, с клетками мышиной миеломы Р3-X63-Ag 8.653. Штамм ВСКК (}})

276 Д депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночника Института цитологии АН

СССР. Продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М (IgM), специфически направленные к антигену 8. Титр иммуноглобулинов в

ИФА в культуральной жидкости до 40, а асцитной жидкости до 10, титр антител в асцитной жидкости в непрямом иммуноофлюоресцентном анализе до 10 . э

Стабильность антителопродукции штамма з сохраняется на протяжении 50-52 пассажей в культуре и.5 пассажей на животных (срок наблюдения). 4 практически не удается дифференцировать между собой возбудителей сапа и мелиоидоза; что свидетельствует об их черезвычайно высоком антигей ном сходстве. (Л

Актуальным представляется использование С) возможностей гибридомной технологии для получения МкАт, обладающих видовой специфичностью к данным возбудителям, или специфичных к маркерам определенных биологических свойств.

Цель изобретения — штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к антигену возбудителя мелиоидоза — маркеру вирулентности.

1791450

Штамм гибридных культивируемых клеток Моз musculus L., — продуцент моноклональных антител к поверхностному антигену 8 возбудителя мелиоидоза пол-. учен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/с, предварительно иммунизированных суспенэией убитых бзктериальных клеток возбудителя мелиоидоэа, с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag 8,653 с помощью полизтиленгликоля (ПЗГа), селекции на гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой среде (ГАТ) и последующего клонирования полученных гибридом методом предельных разведений.

Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР 05.07.88 под номером

ВСКК(П)276Д и имеет авторское наименование ММ вЂ” Ppml. 2

Полученный штамм Mus musculus .

ВСКК(П)276Д имеет следующие характеристики.

Условия культивирования штамма: температура 37"С, атмосфера с 5% СО и 98% 2 влажностью, среда RPMI-1640, содержащая

10% сыворотки плода коров, 10 мМ ГЗПЗС (N-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфо новая кислота), 2мМ 1-глутамина, без энтибиотиков или с добавлением пенициллина и стрептомицина 100 ЕД/мл. 3

Характер роста — стационарная суспензия. Культура представляет собой взвесь одйночных клеток или легко разъединяющихся при встряхивании рыхлых агрегатов по 6-14 и более клеток. Оптимальная посев- 3 ная доза — 1,5 — 2 х 10 клеток в 1 мл среды.

Для поддержания культуры в профилирующем состоянии клетки рассеивают два раза в неделю через 2-4 дня с кратностью рассева 1:4-1:10. Максимальная плотность насы- 4 щения с сохранением жизнеспособности—

8х10 -10 клеток в 1 мл, Клетки в культуре

5 6 выглядят округлыми, прозрачными, Для получения асцитной жидкости мышей линии ВА В/с сенсибилизируют путем 4 внутрибрюшинного введения 0,5 мл пристана или вазелинового масла и через 7-14 дней после этого им вводят гибридные клетки в,дозе 3-5х10 клеток нз мышь.

В реакциях иммунофлюоресценции, 5 преципитзции в геле и иммуноферментном анализе (ИФА) продуцируемые гибридома-. ми антитела взаимодействуют с антигеном

8 возбудителя мелиоидоза с абсолютной специфичностью.. 5

Моноклональные антитела относятся к классу иммуноглобулинов (Ig) M. Титр иммуноглобулинов в ИФА в культуральной жидкости — до 40, в асцитной жидкости — до 10; титр МкАт в асцитной жидкости в непрямом иммунофлюоресцентном анализе (НИФлА) — до 10 . Стабильность антителопз родукции сохраняется на протяжении 50-52

5 пассажей в культуре и 5 пассажей нз животных (срок наблюдения).

Проверка штамма на присутствие контактирующих микроорганизмов, проведенная на культурах постоянно выращиваемых

10 на среде без антибиотиков, показала отсутствие бактерий и грибов;

Штам хранят в замороженном состоянии при температуре -196 С. Среда криоконсервирования содержит: среды

15 ВРМИ640 — 73% сыворотки плода коровы — 20%, диметилсульфоксида (ДМСО)—

7%. Ампулы содержащие 0,5 мл суспензии клеток (6х10 /мл) после выдерживания в течение 30 минут при температуре 4 С и двух

0 часов при температуре -40 С погружают и хранят в жидком азоте, Жизнеспособность клеток проверяют после размораживания с помощью суправитального красителя—

0,2% раствора трипанового синего. Она со5 ставляет 80 — 95%.

Пример 1. Использование штамма

Mus musculus L. ВСКК(П)276Д для получения моноклональных айотител.

Моноклональные антитела к антигену 8 возбудителя мелиоидоза получают из куль0 туральной жидкости (среды), в которой клетки штамма выращивают вне организма и иэ асцитной жидкости мышей, которым" клетки штамма вводят внутрибрюшинно.

Для получения антител иэ культураль5 ной жидкости клетки штамма выращивают в стандартных условиях: при температуре

37 С, влажности 98%, COz — 5% в среде культивирования. Затем производят постепенный рассев культуры, Клетки выдерживают

0 для пролиферации без смены среды до достижения максимальной плотности, при которой клетки погибают. Культуральную жидкость осветляют центрифугированием и используют как источник антител.

Для определения титра моноклональных антител в ИФАтитрование проб культуральной жидкости проводят путем 8 .последовательных разведений образцов с

0 двукратным шагом (1:2 — 1:128) в лунках планшетов, сенсибилизированных водносолевым экстрактом возбудителя мелиоидоза. В качестве отрицательного контроля используют насадочную жидкость несекре5 тирующей антитела миеломной клеточной линии Р3-X63-Ag 8,653, в качестве положительного — сыворотку мышей, иммунизированных убитыми бактеризльными клетками возбудителя, Результаты реакции учитыва1791450 ют визуально или с помощью вертикального спектрофотометра.

За титр антител принимают величину обратную наибольшему разведению исследуемого образца антител, давшему положительную реакцию. Титр моноклональных антител к антигену возбудителя мелиоидоза в культуральной жидкости равен в ИФА 40.

Для получения асцитной жидкости. содержащей МкАт, мышам линии BALB/c вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана или вазелинового масла, а спустя 7 — 14 дней также внутрибрюшинно вводят 3-5 мл. гибридных клеток штамма, выращенных "ин витро". Асцит развивается в течение 7-28 дней. Клетки опухоли отделяют путем центрифугирования асцита и перевивают новой группе мышей, а жидкость используют как источник антител. Объем асцитной жидкости, полученный от одной мыши, составляет

0,5-3 мл.

Определение титра антител с асцитной жидкости проводят также, как и в культуральной. Асцитную жидкость разводят с 10кратным. шагом начиная с 1:10, делая 8 последовательных разведений образцов в лунках планшетов. В качестве отрицательного контроля используют нормальную мышиную сыворотку мышей линии BALB/c.

Титр антител в асцитной жидкости состав104106

Для определения титра антител в иммунофлюоресцентном анализе делают 6 последовательных разведений асцитной жидкости с 10-кратным шагом.(1-:10 — 1:106).

Для разведения используют физиологический раствор NaCI, содержащий 0,05% твина-20. Пробы антител в разведениях в объеме 10 микролитров наносят на предметное стекло с предварительно фиксированными на нем микробными клетками. . Стекла выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут, ополаскивают физиологическим раствором. Реакцию проявляют препаратом кроличьего антимышиного глобулина меченого ФИТЦ в рабочем разведении (производство ИЭМ AMH

СССР). Через 20-30 минут инкубации стекло отмывают физиологическим раствором, затем дистиллирозанной водой, высушивают и просматривают под масляной иммерсией в люминисцентном микроскопе.

Положительной считается реакция иммунофлюоресцении, оцениваемая на 3+ и выше при 4" -бальной системе оценки, Титр антител в асцитной жидкости гибридного штамма составляет в ИФлА 1:10 — 1:10 .

10

Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток мышей ВСКК(П)276Д, полученные иэ культуральных и асцитной жидкостей, высаливают раствором сульфата аммония при

50%-ном насыщении, подвергают диализу против фосфатно-солевого буфера с последующей лиофилиэацией и хранят при температуре 4 С в течение года беэ потери активности.

Пример 2, Использование моноклональных антител, полученных на основе предложенного штамма, для определения возбудителя мелиоидоза и его антигена в

ИФлА и реакции преципитации в геле.

Для выявления возбудителя мелиоидоза на стекле с предварительно фиксированными клетками исследуемых штаммов или

20 мазками-отпечатками органов наносят 5-10 микролитров антител в разведении, в 2-5 раз меньшем титра, установленного при оценке их активности, Стекла выдерживают в течение 30 минут при комнатной темпера25 туре и несколько раз отмывают физиологическим раствором. После 3Tol на стекла наносят препарат кроличьего антимышиного глобулина меченого ФИТЦ в рабочем разведении, Через 20-30 минут стекла

30 отмывают физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают. Препараты просматривают в люминисцентном микроскопе при малом увеличении под масляной иммерсией, при

35 этом микробные клетки возбудителя мелиоидоза показывают специфическое свечеwe.

Выявление антигена 8 возбудителя мелиоидоза возможно при помощи реакции

40 преципитации по Ухтерлони, что обусловлено принадлежностью данных МаАт к IgM.

- Появление зоны преципитации свидетельствуют о наличии данного антигена в исследуемом материале и позволяет

45 идентифицировать .вирулентные штаммы возбудителя мелиоидоза (Петерс M,Ê.. Пивень Н,Н., Илюхин В.И., Барков А.M. Характер изменений антигенного спектра возбудителя мелиоидоза при пассиро50 вании на животных, ЖМЭИ, 1983, М 8, с.47-49}.

Штамм гибридн ых кул ьтиви руемых клеток мыши продуцирует МкАт, позволяющие дифференцировать патогенные псевдомо55 нады (Pseudomonas pseudomallel и др.) по наличия у них маркера вирулентности — антигена 8 — в иммунофлюоресценции, ИФА, в реакциях иммунодиффузии в геле, оценивают наличие антигена 8 в микробной клет1791450 б

Составитель B. Свиридов

Редактор С; Кулакова Техред М.Моргентал Корректор С,Патрушева

Заказ 134 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-Э5, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 ке на различнйх этапах ее развития. Данные методы быстры и зкономичны, поскольку исключают необходимость применения используемых в настоящее время тестов, основанных на сравнении биохимических и культуральных свойств микроорганизмов рода Pseudomonas.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L ВСКК (II) ЬЬ 276Д— продуцент моноклональных антител к анти5 гену 8 возбудителя мелиоидоза Pseudomonas pseudomallel.