Способ определения токсичности водорастворимых веществ

 

Использование: токсикология, охрана окружающей среды, экология, химико-фармакологическая промышленность, санитарно-гигиенического Надзора. Сущность изобретения: клетки млекопитающих, культивируемые Hela, помещают в жидкую питательную среду (20-30 клеток/мл). Туда же добавляют 1 : 50-1 : 100 (в мае. %) раствор токсиканта. Образцы инкубируют до появления макроколоний. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕ ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4883415/13 (22) 08,08.90 (46) 23.01,93, Бюл. М 3 (71} МГУ им. М.В.Ломоносова Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф,Эрисмана (72) Л.P.Àíâàåâà, И,М,Пархоменко, E.Ý.Ãðàевская и Г.В,Гуськов (56) Строганов Н.С., Дмитриева А.Г., Король

В.M. Водоросли и макрофиты как обьекты для биотестирования. Волгоград, 1983, с, 153-158.

Пакхам Е,Д., Дуксбури С.О.. Майфилд С.

О, и др. Количественный анализ вызванных загрязнителем летальных и сублетальных поражений культивируемых клеток млекопитающих: Экспресс-информация ВНИИМИ. Гигиена окр. среды, М 6. — M., 1983, с, 26.

Изобретение относится к способам определения биологической активности соединений в водной фазе и может быть использовано в токсикологии, охране окружающей среды; экологии, химико-фармакологической промышленности, при санитарно-гигиенических исследованиях в научно-практических учреждениях санитарно-гигиенического надзора, Известен способ определения токсичности жидкостей путем обработки токсикантом микро- и макроводорослей с подсчетом соотношения живых и мертвых клеток и некротизированных участков. Известен способ оценки токсичности водорастворимых соединенйй путем обработки токсикантом культивируемых млекопитающих с последующей инкубацией и определением репродуктивной гибели клеток.

„„59„„1789559 А1 (я)з С 12 N 5/00, G 01 N 33/18 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Использование: токсикология, охрана окружающей среды, экология, химико-фармакологическая промышленность, санитарно-гигиенического надзора. Сущность изобретения: клетки млекопитающих, культивируемые Hefa, помещают в жидкую питательную среду (20-30 клеток/мл). Туда же добавляют 1: 50 — 1; 100 (в мас, ф) раствор токсиканта. Образцы инкубируют до появления макроколоний. 2 табл.

1»

Цель изобретения — упрощение, повышение экономичности и точности "способа определения токсичности водорастваримых веществ.

Способ заключается в следующем. Бе- О© рут клетки млекбпитающйх Hefa, культиви- Q руемые in vftro, помещают в жидкую (Я питательную среду в равной койцентрации (Л (20-30 мл/мл) в контрольных и опытных об- о разцах. Выбор такой плотности связан с тем, что.повышенйе плотнбстй Нфйводит к " снижению точнбсти за счет слйяния колоний; при снижении плотности также происходит снижение точности определения за " счет уменьшения эффективности посева, Затем в опытные пробирки с инокулированными добавляют в соотношении 1: 50-1:

100 (в мас, $) раствор токсиканта (0,1-0,05 мл раствора испытуемого вещества, содер=" " жащего такую концентрацию, которая при t789559 указанной операции разбавления создает выбранную рабочую концентрацию). В контрольные пробирки-в том же соотношении добавляют солевой раствор, используемый. для приготовления растворов токсиканта, После этого образцы инкубируют в герметически закрытых сосудах при 37,0-37,5 С в течение времени, необходимого для появления макроколоний, и судят о токсическом действии соединения при статическом до- 10 стовернбм отклонении числа колоний в присутствии токсиканта по сравнению с контрольным образцом.

Предлагаемый способ определения токсичности водорастворимых веществ имеет 15 явные преимущества перед известным, чувствительность способа повышается в 30 раз. Материалы, представленные в таблице, иллюстрируют достижение цели, Предлагаемый способ более экономи- 20 чен, так как отпадает необходимость в использовании дорогостоящего оборудования для создания стерильной газовой среды постоянного состава и влажности в термостатируемой камере, более прост, так как не 25 содер>кит операций, необходимых для создания различных концентраций клеток s опытных и контрольных образцах, а также операций, связанных с внесением токсиканта в физиологическом растворе, а затем 30 заменой раствора на среду культивирования, потому что в предлагаемом способе токсикант вносят непосредственно весь срок инкубации до появления видимых макроколоний. 35

Пример 1, Для подготовки культуры клеток He)a берут в виде монослоя в стеклянном матрасе емкостью 0,5 л в среде следующего состава: среда 199-45 %, среда

Игла 48 %, сыворотка крупного рогатого 40 скота без консерванта 7 %, стрептомицина по 250 ед/мл. На третий день культивирования клетки снимают со стекла 0,25 %-раствором трипсина, ресуспендируют в питательной среде, разбивают комки клеток 45 пикетированием, подсчитывают число клеток е 1 мл и готовят суспензию одиночных клеток в культуральной среде с плотностью

20 клеток/мл, по 5 мл суспензии клеток, т, е.

100 клеток на пробу, инокулируют в 10 ка- 50 мер, 5из них служат контролем,,в 5 вносят

5 х 10 мг процента хлорофоса. Клетки культивируют при 370 С до появления видимых невооруженным глазом макроколоний, за- тем подсчитывают число выросших колоний 55 е. контрольных и опытных камерах, Среднее . число колоний в контрольных пробирках 98, + 1,16, среднее число колоний в опытных камерах 82,5+ 1,5, т. е. выживаемость клеток при действии хлорофоса в концентра--:. ции 5 х 10 мг % равна 84,2 % от контроля, Пог учают нижний предел определения хлорофоса, равный 5 х 10 мг,/..

Предлагаемый способ пв сравнению с известным имеет повышенную чувствительность при упрощении определения токсичности водорастворимых веществ, Пример 2. Осуществляют, как пример

1, но в опытные камеры вносят 107 мг хлорофоса, контрольные и опытные пробы культивируют около 8 дней. Среднее число колоний s контрольных пробир- ках 98,0 и 1,6, в опытных 48,2+1,8, т, е. выживаемость равна 46,1 7 от контроля, что свидетельствует о высокой токсичности данной концентрации хлорофоса на репродуктивную способность клеток млекопитающих.

Пример 3. Осуществляют, как пример

1, но в опытные пробирки вносят 5-метокситритамин в концентрации 1 х 10 мг .

Среднее число колоний в контрольных пробирках 91,1 +. 2,2, в опытных — 42,2 1,4 т, е, выживаемость равна 46,1 %, высокотоксичное соединение, П р и мер 4.Осуществляют, как пример

1, но в опытные пробирки вносят 2-амиачно2-тиазолин 10 з мг g, и получают выживаемость 49 Д по сравнению с контролем.

Пример 5, Осуществляют, как пример

1, но в опытные камеры не вносят токсикант, а производят замену среды на свежую среду того же состава. После образования видимых макроколоний производят их подсчет в опытных и контрольных камерах. 8 контроле среднее число колоний составляет 82,0 +6,3, вопытах-74,8+ 5,9, т. е,91,2

% от контроля, Таким образом, процедура смены среды приводит к снижению числа колоний порядка 10 %.

Пример 6. Осуществляют, как пример

1, лишь суспензию одиночных клеток берут в концентрации 30 клеток/мл. Выживаемость клеток при действии хлорофоса в концентрации 5х10 мг% равна 84,1+.0,1, что свидетельствует о высокой сходимости результатов в диапазоне клеток в концентрации от 20-30 клеток/мл (сравнение с примером 1). Данные об эффективности и посева в этих опытах приведены в таблице.

Из данных, представленных в таблице, следует, что именно квнцентрация 20-30 клеток/мл дает допустимун) эффективность посева и наглядно иллюстрирует преимущества предлагаемого способа по,сравнению с прото типом.

Температура культивирования для клеток млекопитающих допустима в" приведенных пределах. Время культивирования

1789559

12 дней, так как после этого колонии из-за изменения рН сползают со стекла и их невозможно подсчитать). клеток зависит от токсиканта, поэтому отмечают появление видимых макроколоний (порядка 8-10 дней со дня посева, но не более

Формула изобретения

Таблица 1

Таблица 2

Составитель B,Þäèí

Техред М,Моргентал

Корректор 3,Салко

Редактор Г,Бельская

Заказ 329 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения токсичности водорастворимых веществ, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, внесение суспензии клеток в термостатируемые опытные и контрольные камеры на период, необходимый для прикрепления клеток, внесение в опытные камеры исследуемого раствора и инкубацию его с последующей оценкой числа макроколоний в опытных и контрольных камерах и отнесение исследуемого раствора при достоверном уменьшении количества макроколоний в опытных камерах, отличающийся тем, что, с целю упрощения и повышения точности способа, культивируют клетки человека Hela, в качестве термостатируемых камер используют герметично закрытые сосуды, суспензию клеток вносят в концентрации 20 — 30 клеток/мл, а инкубацию проводят до появления видимых микроколоний.