Способ получения дидеоксинуклеозидов

 

Использование: в качестве средства против СПИДа. Сущность изобретения: продукт ()-4-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)- тётрагидро-2-фуран-метанол,БФ CioHi3Ns02, т.пл. 183-185°С, выход 50%; |(ЗР-цис)-2-амино-1 .Э-дигидро-Э-Птетрагидро |5-{ оксиметил )-3-фуранил 6 Н-пурин-6-ОН, БФ CloHiaNsOs, выход 40%, т.пл. 229- 230°С. Реагент 1: (2Р-транс)-тетрагидро- 4(4-метилфенил)сульфонил)окси -2-фуранметанол. Реагент 2: аденин или гуанин. Условия реакции: в среде диметилформамида в присутствии 18-краун-б и карбоната калия. (Л С

СОКОВ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧГСКИХ

РЕСПУБЛИК

1809831 А3

tsrIs С 07 Н 19/16

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ.

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

О

СО

СА) (21) 4743207/04 (22) 12.02,90 (46) 15.04,93. Бюп. N 14 (31) 309561 (32) 13,02.89 (33) US (71) Ф.Хофманн-ля Рош АГ (СН) (72) Донна Мэри Хурин, Стив Йик-Кай Там (US) и Манфред Вейгеле (DE) (56) Chong-Ho Kim et, al. "Potential Anti-AIDS

Drugs, 2,3 -Dideoxycitidine Analogues "

I.Med. Chem. 1987, 30, 862-866.

Hiroaki Pritsuja, Samuel Broder

"!пйПЮоп fo the in vitro infectivity and

Cytopathlc effect of humann lymphotropnlc

virus type П! (Iymphadenopathy-associated

virus (HILV-ill/LAV) by 2,3 -dideoxynucleosides. Proc. hdtl. Acad. USA, Vol 83, рр.

1911 — 1915 (1986).

Изобретение относится к способу получения новых дидеоксинуклеозидов общей формулы I где А — 6-амина-9Н-пурии-9-ил или 2-аминоб-гидрокси-9Н-пурин-9-ил, ингибирующих репликацию вируса СПИДа, Цель изобретения — получение новых производных дидезоксинуклеозидов, подавляющих вирус СПИДа и более устойчивых к гидролизу нуклеозидной связи, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИДЕОКСИНУКЛ ЕОЗИДОВ (57) Использование: в качестве средства против СПИДа. Сущность изобретения; продукт (2R-цис)-4-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуран-метанол, БФ

С10Н1зй502, т.пл. 183 — 185 С, выход 50 ; (Зй-цис)-2-амино-1,9-дигидро-9-стетрагидро- .

j5-(оксиметил ) -3-фуранил2-6 Н-пурин-6-0Н, Б Ф С1оН1 МБОз, выход 40, т. пл. 229—

230 С, Реагент 1; (2R-транс)-тетрагидро4((4-метилфенил)суп ьфонил)окси)-2-фуранметанол. Реагент 2: аденин или гуанин, Условия реакции: в среде диметилформамида в присутствии 18-краун-6 и карбоната калия.

Синтез соединений 1 ведут действием аденина или гуанина на соединение общей формулы Il где Х вЂ” п-тозилокси.

Способ осуществляют предпочтительно действием аденина на (2й-транс)-тетрагидро-4-(((4-метипфенил)суп ьфонил)окси)-2-фуранметанол в присутствии 18-краун-6 и карбоната калия в диметилформамиде с получением (2R-цис)-4-(б-амино-9Н-пурин-, 9-ил)-тетрагидро-2-фуран-метанола.

1809831 изобретение поясняется дальше нижеследующими примерами, Пример 1. B раствор 40 г 1 2-0 (1-метилэтиленден)-а-D-ксилофуранозы в 125 мл хлористого метилена добавляют 40 мл сухоro пиридина. Раствор охлаждают до -5 С и в атмосфере азота в течение 30 минут смешивают с раствором 44,2 г хлористого тозила в 100 мл хлористого метилена, После перемешивания в течение ночи, причем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, добавляют 500 мл хлористого

10 метилена и промывают реакционную смесь

1 раз 600 мл воды, 2 раза 400 мл воды и, наконец, 1 раз 400 мл насыщенного раствора хлористого натрия, Органическую фазу сушат, фильтруют и выпаривают при пониженном давлении. После дальнейшей сушки в течение ночи при 23 С/7 Ра для удаления остаточного пиридина получают 71 г сырого продукта как твердое вещество. Это вещество растворяют в 100 мл хлористого метилена и смешивают с гексаном до помутнения. Смесь оставляют в течение ночи при 0 С, Твердое вещество отфильтровывают, промывают гексаном и сушат на воздухе, причем получают 52,4 r 1,2-0-(1-метилэтилиден)-5-0-р-(толилсульфонил)- a -Dксилофуранозы как белое твердое вещество, Вторую фракцию 5,7 r получают 30 выпариванием маточных растворов (выход

80 ).

Раствор 58,1 r 1,2-0-(1-метилэтилиден)5-0-р-(толилсульфонил)- а -О-ксилофуранозы и 1 л 1,2-дихлорэтана смешивали с 361 г 35 тиокарбонилдиимидазола, Желтый раствор нагревали.2 часа до температуры флегмы, смешивали с остальными 4,2 r тиокарбонилдиимидазола и нагревали еще один час, Реакционную смесь охлаждали и выпаривали 40 растворитель, Оранжевый остаток распределяли между хлористым метиленом и 1,4 л воды. Органическую фазу отделяли, промывали 700 мл воды и затем 500 мл насыщенного раствора хлористого натрия, сушили, 45 фильтровали и выпаривали, Получают 91 г сложного эфира 1,2-0-(1-метилэтилиден)-аD-ксилофуранозы-3-0-(1 Н-имидазол-1-карботиокислоты)-4-метилбензолсульфокислоты (соединение III) как оранжевое твердое 50 вещество.

Пример 2, 600 мл сухого толуола обрабатывают аргоном, на ревают до температуры флегмы и смешивают с 27,1 мл гидрида три-и-бутилолова и 50 мг AIBN.

Этот раствор подают в течение одного часа с раствором 30,3 г полученного в примере 1 соединения в 600 мл сухого толуола. После

2 часов нагревания добавляют 9 мл раствора гидрида три-и-бутилолова и 50 мг AIBN при дальнейшем нагревании, пока тонкослойная хроматография не показывала больше никакого исходного вещества (приблизительно через 1 час). После охлаждения толуол выпаривают, остаток распределяют между 1 л ацетонитрила и 800 мл гексана, выпаривают фазу ацетонитрила и растворяют полученные 27 3 г остатка в минимальном объеме 30 атил-ацетата 70 гексана, Смесь фильтруют через силикагель и элюируют с 30 этилацетат/70 гексана. После выпаривания растворителя остаток растворяют в небольшом объеме простого эфира и смешивают с петролейным эфиром, пока раствор не становится мутным, После охлаждения в ванне с сухим льдом и выдерживания при 0 С в течение ночи получают 9,3 г З-деокси-1,2-0-(1-метилэтилиден)- а -0эритро-пентофуранозы-4-метилбензолсульфоната как белое твердое вещество. Остальные 4 г продукта получают из маточного раствора (выход 61 ).

Раствор 12 г З-деокси-1.2-0-(1-метилэтилиден)- а-0-эритропентофуранозы-4-метилбензолсульфоната в 60 мл сухого хлористого метилена охлаждают в атмосфере азота до

-78 С. Раствор медленно смешивают с 4 мл

1,3-пропандитиола и затем с 5 мл бортрифторидэфирата. Смесь перемешивают 40 часов при — 78 С, затем смешивают с 200 мл хлористого метилена, промывают 2 раза 50 мл насыщенного раствора хлористого натрия, сушат, фильтруют и выпаривают. Слегка окрашенное масло очищают хроматографией на колонке с 50 этилацетата/гексана в качестве растворителя и получают 7 r (2S,4R)-4-(1,3-дитиан-2-ил)-1,2,-4бута нтриол-1-0-(4-метил бен зол сул ьфоната), как бесцветное масло (выход 50 или 90 в пересчете на рекуперированный исходный материал). Далее рекуперируют 5,3 г исходного материала.

Пример 3. Раствор 7 г соединения примера 2 в 20 мл хлористого метилена смешивают с 4 мл пиридина, перемешивают в течение ночи, смешивают после этого с 50 мл хлористого метилена и экстрагируют 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия, Органическую фазу сушат, фильтруют и выпаривают. Остаток растворяют в 10 мл хлористого метилена и смешивают с 5,5 г хлористого тозила в 3 мл пиридина при комнатной температуре в течение ночи. После разбавления 100 мл хлористого метилена, сопровождаемого промывкой 25 мл раствора хлористого натрия, сушки и фильтрования, выпаривания и хроматографии (30 этилацетата/707 гексана) получают 4,2 г

1809831 (2 R)-тра нстетра гидро-5(1,3-дитиан-2-ил)-3

-фуранол-4-метилбензолсульфоната как бесцветное масло; М 360 (M .

Пример 4, Смесь 1 г (2R)-транс-тетрагидро-5-(1,3-дитиан-2-ил)-3-фура нол-4-мет илбензолсульфоната 1,66 r хлористой ртути — (11) и 1,32 г окиси ртути — (ll) в 25 мл 807; ацетонитрила) воды нагревают 5 ч до 80 С, Раствор охлаждают до комнатной температуры, фильтруют и частично освобождают- от ацетонитрила. Остаток разбавляют 50 метанола/воды (10 мл) охлаждают до 0 С и разбавляют затем 100 мг боргидрида натрия, После 15 минут перемешивания при

0 С раствор концентрируют, остаток распределяют между хлористым метиленом и раствором поваренной соли, органическую фазу отделяют, сушат, фильтруют и выпаривают. Полученное масло очищают хроматографией с 60 этилацетата/40 гексана в качестве растворителя получают 530 мг (2 R транс)-тет ра гидро-4-//(4-метил фен ил)сул ьфонил/окси/-2-фуранметанона как масло, которое при охлаждении затвердевает: MS

241 (M — CHzOH).

Пример 5. Раствор 40 г З-деокси-1,20-(1-метилзтилиден)- а -D-зритропентофуранозы-4-метилбензолсульфоната в 800 мл

1 (по обьему) уксусной кислоты в метаноле нагревают 3 дня до 70 С. После охлаждения до комнатной температуры устанавливают величину рН раствора добавкой раствора метоксида натрия до 6,0. Затем выпаривают смесь при пониженном давлении досуха, причем получают (3S-транс)-тетрагидро-5- 3 диметоксиметил-3-фуранол как пенистое твердое вещество. Это вещество смешивают с 160 мл сухого пиридина и 50 r хпористого тозила и перемешивают смесь 15 ч при 0 С, Затем смесь выливают в 400 мл 4 ледяной воды, экстрагируют 2 раза 400 мл хлористого метилена и промывают последовательно 1 н. соляной кислотой, бикарбонатом натрия и водой. Органический раствор выпаривают затем досуха и получают 35,7 г 4 (3$-транс)-тетрагидро-5-диметоксиметил-3

-фуранол-4-метилбензолсульфоната как подвижную жидкость (выход 93 ), (d); ядерный магнитный резонанс ЯМБ (200 МН2, СООз) в 2,00 (m, 2Н), 3,45 ($, 6Н), 3,78, 3,96 5 (АВ of АВХ, 2Н, !дв — 9Hz, 1дх = 2Hz, tax =

4Hz), 4,29 (m, 2 Н), 4,54 (m, 1H).

Пример 6. Смесь 10,0 г соединения примера 5 (е), 50 мл трифторуксусной кислоты и 80 мл диоксана нагревают 5 часов до 5 о

80 С. После охлаждения до комнатной температуры устанавливают величину рН раствора добавкой 1 и натриевой щелочи до 7, смешивают с 1,2 г борогидрида натрия и перемешивают 30 минут при комнатной температуре, Растворитель частично удаляют и остаток экстрагируют 3 раза 100 мл этилацетата, Органическую фазу сушат. фильтруют и хроматографируют 60 этила5 цетата/40 гексана в качестве растворителя. Получают 3,6 r непревращенного исходного вещества и 2,7 г (2R-транс}-тетрагидро-4-(((4-метилфенил)сул ьфонил)окси)-2

-фуранметанола.

10 Пример 7. 50 мг эденина, 100 мг карбоната калия, 97 мг 18-корона-6 и 10 мл диметилформамида перемешивают 30 минут в атмосфере аргона при комнатной температуре. В этот раствор добавляют по

15 каплям при перемешивании раствор 100 мг (2R-транс}-тетрагидро-4-(((4-метилфенил)сульфонил)-окси)-2-фуранметанола в 2 мл диметилформамида. Полученную смесь нагревают до 80 С и перемешивают при этой

20 температуре в течение ночи, После удаления растворители при пониженном давлении твердый остаток очищают хроматографией с 10о метанола/90 хлористого метилена в качестве растворителя.

25 Выделенное вещество очищают дальше обратными фазами HPLC с градиентным элюированием при помощи ацетонитрила/ воды. причем получают 25 мг (2R-цис)-4-(6амино-9Н-пурин-9-ил)-тетрагидро-2-фуран30 метанола, Препарат для анализа кристаллизуют из метанола (т.пл, 183 — 185 С (ск )и +

47,91 (с 0.67, метанол).

Ультрафиолетовый спектр Cage, (МеОН) 260 нм (я 13990); ОЧмакс (рН 1) 210

5, нм (е 19700), 259 нм (c 13600).

Пример 8, 2 14 r аденина, 4,37 r карбоната калия, 417 мг 18-корона-6 и 400 мл диметилформамида перемешивают 30 минут в атмосфере аргона при комнатной

0. температуре, В зту перемешанную смесь добавляют по каплям раствор 5 г(3$-транс)тетрэгидро-5-(диметоксиметил)-3-фуранол-4-метилбензол-сульфоната в 100 мл диметилформамида; Полученную смесь нагрева5 ют до 80 С и перемешивают при этой температуре в течение ночи. После фильтрования и выпаривания растворителя получают твердый остаток. Это вещество пропускают через силикэгель с 7 метано0 ла (93 хлористого метилена в качестве растворителя. Содержащие требуемый продукт фракции собирают и выпаривают и получают 3,0 г (3R-цис)-9-(тетрагидро-5-(диметоксиметил))3-фуранил))-9Н-пурин-6-амина.

5 т.пл. 144 — 146ОC.

Ультрафиолет Сакс. (МеОН) 214 нм (f.

18890), 258 нм (14100): ультрафиолет Aa c., (рН 1 208 нм (е 20000), 258 нм (r. 13780); ультрафиолет kuaxc (pH 13) 259 нм (с: 14120).

1809831

15

Пример 9, Раствор 150 мг соединения примера 6 в 3 мл высушенного диметилформамида охлаждают до -5 С и смешивают с

90 мг азида натрия. Раствор оставляют для нагревания до комнатной температуры, затем нагревают 5 часов до 70 С. После удаления диметилформамида остаток распределяют между 50 мл этилацетата и 10 мл воды, Органическую фазу промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором поваренной соли, водные фазы соединяют, снова промывают этилацетатом, все органические фазы собирают, сушат над сульфатом магния, фильтруют и выпаривают. Вещество гидрируют с

5 мл предварительно высушенного метано- . ла и 15 мг 10% палладия/угля 3 часа при комнатной температуре. Катализатор отфильтровывают и растворитель выпаривают. Получают 54 мг (2R-цис)-4-аминотетрагидро-2-фуранметанола как бесцветное масло: MS99 (M — Н20).

Пример 10. Смесь 184 мг (2R-цис)-4аминотетрагидро-2-фуранметанола, 770 мг

5-амино-4,6-дихлор-пиримидина, 0,44 мл триэтиламина и 16 мл трет-бутилового спир- та нагревают в атмосфере аргона 72 часа до флегмы, после этого летучие вещества выпаривают. Остаток растворяют в 10 мл этилацетата, раствор промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором поваренной соли, сушат, фильтруют и выпаривают, Полученный продукт очищают хроматографией на колонке (50% этилацетата/50% гексана) и получают

220 мг (2R-цис)-4-((5-амино-6-хлор-4-пиримидинил)амино)тетрагидро-2-фуранметанола, Ультрафиолет Макс. (МеОН) 206 нм, 265 нм, 295 нм; ультрафиолет Ямакс. (рН 1) 204, нм, 304 нм.

Пример 11, Раствор 220 мг соединения примера 10 и 5 мл диэтоксиметилэцетата нагревают 120 часов до 100 С. Затем выпаривают летучие вещества и остаток смешивают с 5 мл толуола и 5 мг р-толуолсульфокислоты, После перемешивания при комнатной температуре в течение одного часа и удаления толуола остаток очищают хроматографией на колонке (10% метанола/90% хлористого метилена) и получают

109 мг (2R-цис)-4-(6-хлор-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуранметанола как белое твердое вещество, Ультрафиолет Я акс, (МеОН) 264 нм; ультрафиолет Аакс. (рН 1) 265 нм, Пример 12. Раствор 73 мг (2R-цис)-4(6-хлор-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуран метанола в 15 мл 16% МНз/метанола остав20

55 ляют для реакции в автоклаве из высококачественной стали нэ 96 часов. После выпаривания растворителей и хроматографии на колонке(10% метанола/90% хлористого метилена) получают 20 мг (2R-цис)-4-(6-амино9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фурэнметанола (соединение la) и 38 мг (2R-цис)-тетрагидро-4-(6-метокси-9 Н-пурин-9-ил)-2-фура н ме танола кэк белое твердое вещество: ультрафиолет Аакс. (МеОН) 249 нм; ультрафиолет макс. (pH 1) 250 нм, Пример 13. Смесь 63 мг 2-амино-6хлор-пурина, 100 мг карбоната калия, 97 мг

18-корона-6 и 10 мл диметилформамида перемешивают в атмосфере аргона 60 минут при комнатной температуре. После этого закапывают раствор 100 мг (2R-транс)-тетрагидро-4-((4-метилфенил)сульфонил)окси-2фуран-метанола в 2 мл диметилформамида при перемешивании. Полученную смесь нагревают до 80 С и при этой температуре перемешивают в течение ночи, После удаления растворителя при пониженном давлении твердый остаток очищают хроматографией нэ колонке с 5 метанола/95 хлористого метилена в качестве растворителя. Выделенное вещество очищают дальше обратными фазами — HPLC c системой градиентного элюирования ацетонитрила/воды и получают 30 мг (2R-цис)-4(2-амино-6-хлор-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуранметанола как белое твердое вещество: ультрафиолет Айзакс. (EtOH) 221 нм, 240 нм, 303 нм.

Пример 14, Раствор 4,35 г (3R-цис)-9(тетра гидро-5-(диметокси метил)-3-фура н ил

)-9Н-пурин-6-амина в 200 мл 0,1-молярного раствора щавелевой кислоты нагревали 18 часов до флегмы и получают (2R-цис)-,4-(6амино-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуранкарбальдегид. После охлаждения до комнатной температуры содержащий полученное соединение раствор нейтрализуют 1 н натровым щелоком. Полученную смесь смешивают с 50 мг PtOz и перемешивают в атмосфере водорода 48 часов. После фильтрования, выпаривания и очистки хроматографией на колонке (5 метанола/95% хлористого метилена) получают 2,0 r (2Rцис)-4-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуранметанола (соединение la) как белое твердое вещество. В случае необходимости можно очищать продукт дальше перекристаллизацией из метанола, Пример 15. Раствор 170 мг (2R-цис)4-(2-амино-6-хлор-9Н-пурин-9-ил)тетрагидро-2-фуранметанола в 25 мл 1 н соляной кислоты нагревают 3 часа до флегмы. Реакционную смесь нейтрализуют 40 раство1809831

10 ром едкого кали и затем выпаривают до белого твердого вещества. Очистка обратными фазами — MPLC с градиентным элюированием ацетонитрилом/водой дает 65 мг (3R-цис )-2-амина-1,9-дигидро-9(тетрагидро- 5

5-(окси метил)-3-фура нил)-6Н-пурин-6-она (соединение !б) как белое твердое вещество, точка плавления 229-330 С; ультрафиолет макс (pH 0) 205 нм, 253 нм, 278 нм; ультрафиолет Я а«. (рН 6) 252 нм, 270 нм; ультра- 10 фиолет Q>«. (рН 13) 255 нм, 268 нм, Пример 16. Соединения la и !б испытывали на их анти-HIV-активность по описанному Mltsuya et al in Proc Nat I Acad Sci

США, 83:1911 (1986) тесту. 15

Клетки собирали или с соединением la, соединением l6, или с З-амидо-2,3-дидеокситимидином (AZT), и выжившие клетки определяли через 7 дней, Результаты представлены на фиг,1, 20

Черные колонки представляют выжившие, обработанные клетки в присутствии HIY (HTLY-!!!), Светлые колонки представляют выжившие, обработанные клетки в присутствии вируса, 25

Соединения !а и !б показывают антиHIY-активность, которая эквивалентна активности известных антиретровирусных терапевтических средств, которые в живом организме эффективны против HIY, особен- 30 но AZT.

Пример 17, Испытание соединений la и !б на анти-HIY-активность в ELISA-тест системе.

ELISA-тест (Enzyme Linked Immuno- 35

absorbant Assocy) использовали для испытания анти-HIY-активности соединения la u б, причем рост вируса в С04 Т-лимфоцитах измеряли обнаружением антигена, который переходил в надосадочную жидкость ткане- 40 вой культуры инфицированных клеток.

Вирусные препараты с высоким титром (HIY, HTLYlll, RF-штамм) культивировали в . Н9-клетках в РРМ1 1640 (Flow Laboratories), который был дополнен 10 $-ной эмбрио- 45 нальной сывороткой, теленка, 100 10/мл пенициллина и 100 мг!мл стрептомицина, Осколки клеток удаляли центрифугированием с низким числом оборотов и надсадочную жидкость хранили при — 70OC до 50 употребления. Примененной клеткой хозяина была С81 66CD 4+-Т-клеточная линия,. которая особенно чувствительна против инфекций MIY. Клетки инкубировали с 10

ТС10щ HIY/HTLY Ill(RF) 90 минут при 37 С 55 и затем трижды промывали PBSA. Делящиеся без остатка части (2 х 10 клеток) инкубировали в 1,5 мл питательной среды в 6 мл пробирке при 37 С; Через 72 часа после инфекции надосадочные жидкости из культур клеток сразу проверяли на HIY-антиген, Для обнаружения антигена применяли

ELISA Coulter (Luton, UK), Тесты проводили с надсадочными жидкостями из инфицированных культур клеток по инструкции изготовителя. При каждой серии тестов включали положительные и отрицательные внутренние контроли вместе с контролем из надосадочной жидкости неинфицированных клеток. Пластинки с культурами оценивали при помощи соответствующей спектрофотометрической детекторной системы.

Результаты ELISA-теста с соединением

la u ddA (известное анти-HIY-средство) указа н ы ниже. !

С „. (MMon) соединение

3 — 10 !а

1 — 3 ddA

Соединение la показало в этой тест-системе антивирусную активность, сравниваемую с известным анти-Hiv-средством бдА.

Формула изобретения

1. Способ получения дидеоксинуклеозидов общей формулы А но д где А — 6-амино-9Н-пурин.-9-ил или 2-аминоб-гидрокси-9Н-пурин-9-ил, отличающийся тем, что соединение общей формулы с но () в которой X — п-тозилокси, подвергают взаимодействию с аденином или гуанином.

2, Способ по п,1, отличающийся тем, что (2R-транс)-тетрагидро-4-(((4-метилфенил)сульфонил)окси)-2-фуранметанол подвергают взаимодействию с аденином в присутствии 18-краун-6 и карбоната калия в диметилформамиде до получения (2R-цис)4-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)-тетрагидро-2-фуранметанола.