Способ получения о-ацилированных глюкозаминогликанов

 

Использование: в медицине. Сущность изобретения: -о-ацилированные глюкозаминогликаны получают ацилированием глюкозаминогликанов в виде триили тетрабутиламмониевых солей ангидридами карбоновых кислот при комнатной температуре , в полярном органическом растворителе в присутствии акцептора кислоты с последующей очисткой целевых продуктов. Акцептор кислоты - пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин. После ацилирования продукты осаждают с помощью раствора ацетата натрия в этаноле , осадок растворяют в воде, и раствор диализуют против воды. Диализ осуществляют в присутствии слабого основания. 3 з.п,ф-лы, 8 табл., 8 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4614804/05 (22) 21.07.89 (46) 30.07.93. Бюл. М 28 (31) 8809885 (32) 21,07.88 (33) FR (71) Санофи (FR) (72) Морис Петиту и Жан Шоай (FR) (56) Патент США 1Ф 4692435, кл, С 08 В 37/10, 1987.

ЕР 37319, кл, С 08 В 37/10, 1981.

Патент США гк 4686288, кл. С 08 В 37/10, 1987..

ЕP 244235, кл. С 08 В 37/10, 1987.

EP 244236, кл. С 08 В 37/10, 1987

ЕР 40144, кл. С 08 В 37/10, 1981.

ЕР 121067, кл. С 08 В 37/10, 1984, Патент США М 4281 1.08, кл. С 08 В 37/10, 1981.

Патент Франции М 2159724, . кл, С 08 В 37/10, 1987.

EP 2 15453, кл, С 08 В 37/10, 1987.

EP 44228, кл. С 08 В 37/10, 1982.

Патент Франции % 2100735, кл. С 08 В 37/08, 1987.

EP 256880, кл. С 08 В 37/10, 1988.

Изобретение относится к получению биологически активных полисахаридов, которые могут быть использованы в медицине.

Под термином "глюкозаминогликан" понимают вещества. образованные последовательностями уроновых кислот(0-глюкуроновая кислота или L-идуроновая кислота) и аминосахаров, причем эти последние представляют собой глюкозамины или галактазамины.

„„5Q 1831487 А3 (я)ю С 08 В 37/10, А 61 К 31/725 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-АЦИЛИРОВАННЫХ ГЛЮКОЗАМИНОГЛИКАНОВ (57) Использование: в медицине. Сущность, изобретения: -о-ацилированные глюкозаминогликаны получают ацилированием глюкозаминогликанов в виде три- или тетрабутиламмониевых солей ангидридами карбоновых кислот при комнатной температуре, в полярном органическом растворителе в. присутствии акцептора кислоты с последующей очисткой целевых продуктов.

Акцептор кислоты — пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин.

После ацилирования продукты осаждают с помощью раствора ацетата натрия в этаноле, осадок растворяют в воде, и раствор диализуют против воды. Диализ осуществляют в присутствии слабого основания.

3 з.п.ф-лы, 8 табл., 8 ил.

Глю коза мино гл ика н ы и риродного и роисхождения образованы более или менее однородными смесями последовательно соединенных дисахаридных единиц: образованных уроновой субъединицей (глюкороновая кислота или идуроновая кислота) и озаминной субъединицей (глюкозамин или галактозамин), объединенных связью 1 - 4 или 1 -"3;

В глюкозаминдиканах гидроксильные группы по разному замещены функциональ1&31487 сн2Он

О- (A) в известных случаях 2-сульфатированной;

50 — метод окислительной деполимеризации(7, 8), который разрезает молекулу путем окисления, сохраняя "природные" окончания.

Другие гепарины н.м.в., которые имеют

55 молекулярное распределение, отличающееся от тэкового природного гепэрина, обладают особыми биологическими свойствами, могут быть получены иодным окислением природного гепарина, с последующей депоными группами, в особенности сульфатными группами, причем амино-группы озаминов замещены сульфатными и/или ацетильными группами..

Глюкозаминогликаны, рассматриваемые здесь, включают 6 типов продукта: гепарин, гепарин-сульфат, хондроитинсульфат А, хондроитин-сульфат С, хондроитинсульфат В, более точно называемый дерматан-сульфат, и гиалуроновая кислота.

Они характеризуются двумя следующими основными дисахаридными структурами (А) и (В); в которой R обозначает группу 30з и/или ацетильную группу и знак указывает, что карбоксильная группа может быть ниже плоскости цикла (идуроновое звено) или выше плоскости цикла (глюкуроновое звено), и

Глюкозаминликаны, обладающие основной структурой (А), представленной выше, называют глюкоэаминогликанами (или

GAGS) гепаринового типа и включают гепэрины и гепарин-сульфаты, а глюкозаминогликаны, имеющие структуру основания (В), представленную выше, называют GAGS типа хондроитин-сульфата и включают хондроитин-сульфаты А и С и дерматан-сульфат.

Гиалуроновэя кислота имеет основную структуру (В), в которой галактоэамин заменен на глюкозамин.

Кэк указано выше, как в GAGS гепаринового типа, так и в GAGS типах хондроитин-сульфата, более или менее высокое процентное содержание гидроксильных групп в "и" дисахаридных единицах находится в форме сложных эфиров серной кислоты.

Так, гепарин может быть представлен основной структурой (А), указанной выше, в которой "и" может изменяться от 1 до 80..R в большинстве "и" единиц обозначает группу 80з, и, в остальных случаях, ацетильную группу; группы OH в положении 6 глюкоээмина и в положении 2 уроновой кислоты в большинстве случаев сульфатированы, тогда как группа ОН в положении 3 глюкозами5

30 нэ сульфатирована только в меньшинстве случаев; ОН в положении 3 уроновой кислоты практически не сульфатирована, причем вышеуказанная уроновая кислота в большинстве случаев представляет собой идуроновую кислоту.

Продукты, имеющие основную структуру (А), включают также N-десульфатированный N-ацетилированный гепарин. Этот гепарин представлен формулой (А), в которой R обозначает ацетильную группу.

Гепарин также содержит формы, имеющие структуру (А), с "и" изменяющимся от 3 до 15; и тот же самый химический профиль, Вышеуказанные формы могут быть выделены фракционно согласно известным методам и называются гепаринами низкого молекулярного веса (н.м.в.).

Гепарины н.м.в„имеющие молекулярное распределение и обладающие биологическими свойствами, по существу идентичны таковым гепаринов н.м.в., получаемыми путем фракционирования, могут быть получены фрагментацией гепаринэ согласно следующим методам: — метод азотистокислой деполимеризации и восстановления (2, 3), который разрезает молекулу, атакуя субьединицы глюкоэамин-N-сульфата, чтобы дать концевой 2,5-ангидроманнитол: сн,сн сн он в известных случаях сульфатированных

h0 первичной гидроксильной группе в положении 6. — метод ферментативной деголимеризации (4, 5) или щелочной деполимеризации (6), который разрезает молекулу, атакуя уроновые субъединицы, чтобы дать окончание в виде а, Р-ненасыщенной уроновой кислоты: СОО

1831487

СОО

15

30

40

О (cl

55 лимеризацией, путем /3-элимирования или кислотного гидролиза, Иодное окисление разрезает несульфатированные звенья урановой кислоты между углеродами в положении 2 и 3. Известно, что такие звенья присутствуют в участке связи с антитромбином lit (AT ill), плазматическом ингибиторе коагуляции различных серин-протеаз, и активность которых сильно увеличивается за счет гепарина, действующего как кофактор, Иодное окисление, следовательно, позволяет получать продукты, лишенные участка связи с AT ill, и, следовательно, по существу лишенные антикоагулирующей активности.

Гепарины н.м.в. этого типа могут быть получены в особенности при осуществлении способа, включающего следующие стадии: — осторожное окисление гепарина, реализуемое путем введения в реакцию гепарина, в виде водного раствора с конечной концентрацией 0,5-5 (вес/объем), с солью . иодной кислоты при конечной концентрации 0,5-1 (eec/объем), при рН, равном

4,5 — 6 5, предпочтительно при рН 5, при температуре 0-10 С, в течение 15 — 48 часов, в отсутствие света; — деполимеризация полученных гепариновых цепей путем присоединения сильного основания, такого как гидроксид натрия при рН выше примерно 11, а именно от 11 до 12, предпочтительно при 11,2-.11,6, предпочтительно вблизи 11,5; — восстановление фрагментов деполяризации с помощью восстановителя и, после удаления, в желательном случае, восстановителя, который не прореагировал; — рекуперация восстановленных фраг. ментов гепарина путем осаждения с помощью растворителя, в котором они нерастворимы; — выделение искомых фрагментов путем фракционирования с помощью спирта, в присутствии неорганической соли, полученного водного раствора; снова растворяя в воде, выделенный ранее осадок, и рекуперируя образовавшийся осадок.

Эти гепарины н.м.в. отвечают формуле (С) сн,он

3 NHQ в которой "и" может изменяться от 6 до 15;

R по.крайней мере в 90;ь "и" единиц представляет собой группу 50з, и, в остальных случаях, ацетильную группу, причем группы

ОН в положении 3 глюкоэамина могут быть сульфатированы, а группы 0Н в положении

6 глюкозамина сульфатированы на 70 . Более того, по 1 звену на 2 цепи по крайней мере этого гепарина н.м.в. имеют замену идуроноаой кислоты на звено уроновой кислоты (D-глюкуроновой или 1=идуроновой), не сульфатированной, раскрытой между углеродами в положениях 2 и 3, следующей формулы:

Такие гепарины н.м.в. могут быть еще фракционированы гель-фильтрацией согласно известным способам, чтобы получить смеси фар фрагментов, однородных с точки зрения их молекулярной массы, лишенные участка связи с AT И1.

20 Другие глюкозаминогликаны гепариноваго типа образованы GAGS формулы(А) или (С), в которых карбоксильная функция урановой кислоты этерифицирована, например, путем конденсации со спиртом в присутствии агента конденсации карбодимидного типа (9) или путем алкилирования карбоксила с помощью алкилгалогенида в присутствии слабого основания, Точно также, глюкозаминогликаны типа хондроитин-сульфата образованы глюкозамингликанами формулы (8), в которых карбоксильные функции урановых кислот этерифицированы, например, путем алкилирования карбоксила с помощью алкилгалогенида в присутствии слабого основания, Такие сложные эфиры для гиалуроновой кислоты получают путем обработки гиалуроновой кислоты в форме соли четвертичного аммония спиртом в присутствии катализатора или этерифицирующего (превращающего в простой эфир).агента (10), Гепаргн-сульфат представлен вышеприведенной формулой (А), в которой "и" может изменяться от 1 до 80, R обозначает в большинстве видов ацетильную группу и в меньшинстве видов группу S з. Кроме того, в преобладающем большинстве форм, группы ОН в положении 6 глюкозамина сульфатированы, причем урановая кислота в большинстве форм представляет собой глюкуроновую кислоту.

Хондроитин-сульфаты А и С представлены вышеприведенной формулой (В), в которой "и" изменяется от 1 до 80, соответственно, группы 4-0Н и 6-0Н глюкозамина сульфатированы, причем уроновая кислота в большинстве форм представляет собой глюкуроновую кислоты.

Дерматан-сульфат имеет структуру, по существу идентичную таковой хондроитин7

1831487 сульфата А, но субъединица уроновой кислоты представляет собой идуроновую кислоту в большинстве случаев.

Фрагменты дерматан-сульфата, отвечающие вышеприведенной формуле (В), в которой "и" может изменяться от 1 до 20, могут быть получены иодным окислением с последующим восстановлением боргидридом натрия и кислотным гидролизом, как описано у FRAN.

Глюкозаминогликаны обладают многочисленными биологическими активностями, среди которых можно назвать их активности по отношению к факторам коагуляции, которые могут осуществляться через посредство различных плазматических протеинов. В том, что касается гепарина, также из литературы известно, что гепарин или некоторые из его.производных, обладающие или нет антикоагулирующей активностью, могут иметь регуляционную активность пролиферации гладких мышечных клеток сосудистой стенки или еще ингибирующую активность гепараназы, фермента, принимающего участие в механизмах метастазного распространения. Кроме того, глюкозамингликаны составляют часть более широкого семейства сульфатированных полисахаридов, причем некоторые в более или менее значительной степени обладают противовирусной активностью и в особенности анти-NH-активностью (вирус человеческого иммунодефицита) ВАВА и др.

В нижеследующем тексте используется термин GAGS для обозначения глюкозаминогликана. который либо имеет природную структуру, такую, которая получается зкстракцией, полусинтетическую или синтетическую, либо имеет химически мо..дифицированную структуру на функциональных карбоксильных или аминогруппах, сначала по реакции ацилирования, дающей

GAGS, селективно О-ацилированные.

Несмотря на большой интерес к их фармакологическим активностям. природные

GAGS обладают тем недостатком, что имеют относительно короткий период полураспада, что приводит к необходимости повторных введений. Этот недостаток отчасти временно сглаживается за счет использования, для предохранения и лечения венозных тромбоэов, производных гепарина незначительной молекулярной массы, подкожно. уменьшая таким образом частоту введения инъекций в день.

Тем не менее, большой интерес представляет воэможность иметь в распоряжении производные, обладающие пролонгирующим действием, что позволяет еще снижать частоту введения этих продуктов, увеличивая продолжительность их действия.

Также может представлять большой интерес располагать пролонгированными, не5 антикоагулирующими производными, такими, как производные N-десульфатированного N-ацетилированного гепарина, активность которых как ингибитора гепараназы, фермента, вовлекаемого в метастаз10 ные явления распределения, оценивается очень высоко.

Известны многочисленные производные модифицированных глюкозаминогликанов, чтобы улучшить их фармакокинетику, 15 а именно сложные эфиры с карбоксильной функцией уроновых кислот или с гидроксильными функциями, В особенности используют частичную или полную этерификацию карбоксильных

20 функций гепарина, обрабатываемых в форме соли четвертичного аммония, в инертном растворителе. спиртом или галогенированным производным, в присутствии, в известных случаях, агента конденсации.

25 Производные гиалуровой кислоты, полученные этерификацией с помощью спирта в присутствии катализатора или путем реакции с этерифицирующим агентом до получения простого эфира, также описаны.

30 Кроме того, известны различные способы для этерификации GAGS no первичным и вторичным гидроксильным функциям.

Известен способ получения неполных гидролиэуемых эфиров гепарина и неток35: сичной органической кислоты, например, 4хлорфеноксиизомасляной, 4-хлорфеноксиуксусной, холиновой, никотиновой, пиридилуксусной и др.

При этом указанные соединения получа40 ют реакцией четвертичной соли гепарина с кислотой, активированной карбодиимидом.

Эта реакция дает не только о-ацилированное производное, но и вторичный стабильный продукт в виде сложноэфирного

45 о-ацилиэомочевинного производного. Кроме того условия реакции благоприятны для образования пангидридов и межмолекулярных реакций между кислотными и гидроксильными функциями гепарина, 50 Наиболее близким к предлагаемому является способ этерификации гепарина или низкомолекулярного гепарина воздействием хлорангидрида кислоты в формамиде в присутствии пиридина при температуре

55 40 С, втечение 3-4ч. Получаемые продукты обладают повышенной трансмембранной прони цаемостью.

По окончании реакции добавляется вода и осуществляется диалиэ против йаС! и воды, и последующая миофилиэация.

1831487

Недостатком этого способа является то, что получаемые продукты претерпевают частичную десульфатацию, Кроме того, они Ои N-ацилированы. В связи с этим соотношение групп сульфат/карбоксил в получаемом глюкозами нагл икане изменено.

По указанным причинам получить продукты, обладающие нужными и воспроизводимыми биологическими свойствами, известным способом нельзя.

Цель изобретения — обеспечение селективности. О-ацилирования и получение продуктов с воспроизводимыми биологическими свойствами.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения О-ацилированных глюкозаминогликанов, включающем обработку глюкозаминогликанов ацилирующими агентами в присутствии акцептора кислоты, в среде полярного органического растворителя, с последующей очисткой целевых продуктов, глюкозаминогликаны используют в виде три- или тетрабутиламмониевых солей, в качестве ацилирующих агентов применяют ангидриды карбонавых кислот, и обработку осуществляют при комнатной температуре, При этом в качестве акцептора кислоты используют одно.или несколько соединений, выбранных из группы, включающей пиридин, диметиламинопиридин, триэтиламин и трибутиламин, После ацилирования продукты могут быть осаждены с помощью раствора ацетата натрия в этаноле; осадок растворен в воде, а полученный раствор диализован против воды, Диализ может быть осуществлен в присутствии слабого основания, В частности, в качестве слабого основания может быть ис.пользован бикарбонат натрия.

Введением во взаимодействие растворимой в органической среде соли GAGS, такой, как соль третичного или четвертичного аммония, с ангидридом карбоновой кислоты в апратоннам полярном органическом растворителе, получают селективное ацилирование свободных гидраксидов, без изменения функциональных карбоксильных или аминных групп используемого GAGS. Ис-. пользование GAGS в форме растворимой в органической среде сали позволяет предпочтительно контролировать реакцию ацилиравания с большой точностью. Более того, степень ацилиравания легко модулируется и может быть увеличена, не вызывая при этом изменения остальной части молекулы. Особенна можно достигать степени ацилирования 0,1-3-ацильных групп на дисахаридную единицу, в особенности 0,5-2ацильные группы.

20. изводные гепарина, полученные либо путем

30 ции

35 учаемый путем синтеза, однородный в том, чта касается его молекулярной массы, а так45 когда эти участки разрушены, например, де50 полимеризацией периадатом с последуюния могут быть получены из соединений, 5S приготовленных па способу, использующему иодного окисление с последующим щелочным Р-злиминираванием, васстанов5

Найдено, что при этом не образуется низкое N-ацилированнае производное и что, когда ангидриды образуются на уровне карбоксильных функций, использование слабого основания позволяетлегка их снова превратить в свободную кислоту,, Предпочтительно, селективное ацилиравание GAGS согласно способу изобретения позволяет осуществлять модулиравание их биологических активностей, которые в некоторых случаях сильно увеличиваются.

Наконец, найдено, что О-ацилированные GAGS, полученные таким образом, обладают более проЛонгированной фармакологической активностью.

В предпочтительном способе изобретения, выбранные глюкозаминогликаны представляют собой глюкозаминагликаны гепаринового типа, а именна гепарин, профракцианирования, либо полусинтетическим или синтетическим путем; гепаринсульфат и его производные, полученные путем фракцианирования. полусинтетическим или синтетическим путем, Для получения cMecзй фрагментов гепарика, имеющих молекулярную массу ниже

10000 дальтанов, также можно использовать метод ферментативнай депалимеризаВ другом предпочтительном аспекте изобретения, можно использовать смесь фрагментов гепарина, однородных по их молекулярной массе; фрагмент гепарина, полже в тьм. что касается ега функционализации.

В другом интересном аспекте изобретения, в качестве глюказаминогликана можно выбирать производные гепарина, лишенные участков связи с антитрамбинам

1И (AT III), либо когда гепариновые цепи фракцианированы, чтобы удалить олигосахаридные цепи, включающие участок связи с AT III, прибегая, например, к афинной хроматографии на смоле Сефараза-АТ III или к ионоабменным хроматографиям, либо щим Pэлиминираванием или кислотным гидрол изом.

Особенно предпочтительные саединелением и фракционираванием.

Другими предпочтительными соединениям, отвечающими формуле VI, являются

1831487 смеси соединений, гомогенных по их молекулярной массе, получаемые путем гельфильтрации, в которых "и" обозначает целое число.2-12, Из соединений с гепариновой структурой, лишенных участка фиксации с AT III, и следовательно, лишенных антикоагулирующей активности, семейство предпочтительных соединений соответствует N-десульфатированным N-ацетилированным селективно 010 ацилированным.производным гепарина.

В другом предпочтительном аспекте изобретения, выбираются глюкоэамингликаны типа хондроитин-сульфата, а именно хлондроитин-4 и 6-сульфаты, дерматансульфат, и их фрагменты.

Способ настоящего изобретения отли. чается тем, что глюкозаминогликаны превращают в растворимую в органической

20 среде соль и эту соль обрабатывают ацилирующим агентом, способным селективно ацилировать первичные и вторичные гидроксильные группы этого глюкозаминогликана, не затрагивая функциональные группы

NHRz, или COOR; присутствующие в этом 25 глюкозаминогликане до реакции ацилирОвания, причем реакция осуществляется в апротонном полярном растворителе в присутствии катализатора и в присутствии основания, способного улавливать выделяющуюся

30 бавлять добавку, благоприятствующую осаждению, такую как минеральную соль, О-Ацилированный глюкозаминогликан выделяют путем растворения в воде осадка и

40 предпочтительно диалиэиравания в присутствии слабого основания, Предпочтительно, способ изобретения . осуществляется согласно следующим стади- ям: (1) Гл окозаминогликан предотвращают 45 в соль вышеуказанного глюкозаминогликана, растворимую в апротонном полярном органическом растворителе; . (2) эту соль обрабатывают ангидридом формулы: ацил-О-ацил, в вышеуказанном апротонном полярном органическом растворителе, в присутствии каталитических количеств пиридина, диметиламинопиридина, или триэтиламина или трибутиламина, (3) таким образом полученный продукт осаждают воздействием раствора ацетата натрия в этанола; и (4) селектиено-0-ацилированный глюкоэаминогликан выделяют путем растворения во время ацилирования кислоту, при комнатной температуре.

Продукт затем осаждают. с помощью смешивающегося с водой растворителя, такого как этанол, к которому можно до- 38 в воде таким образом полученного осадка и путем диализа в присутствии слабого основания, и в известных случаях натриевую соль таким образом полученного селективно 0-ацилированного глюкозаминогликана превращают в другую фармацевтическую совместимую. соль.

8 предпочтительном аспекте способа .изобретения, используемый в стадии (1) глюкоэаминогликан. выбирается в группе, образованной. гепарином, смесью фрагментов гепарина„имеющих молекулярную массу ниже 10000 дальтонов, смесью фрагментов гепарина,. имеющих среднюю моле-. кулярную массу 2000-7000 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекулярную массу около 4500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, имеющих среднюю молекулярную массу около 2500 дальтонов, смесью фрагментов гепарина, гомогенных по своей молекулярной массе: фрагментом гепарина, полученным путем синтеза, гомогенным в том, что касается.его молекулярной массы, и в том, что касается.его функционалиэации.

8 другом предпочтительном аспекте способа изобретения, используемым в стадии (1) глюкоэаминогликаном является гепарин, фракция или фрагмент гепарина, лишенные участка связи с антитромбином

И!.

Глюкозаминогликан, используемый в стадии (1} способа изобретения, предпочтительно может быть еще выбран в группе, образованной дерматансульфатом и его фрагментами, или 4- и 6-сульфат-хондроитинами и их фрагментами, Предпочтительно. соль глюкозаминогликана, используемая в стадии (1), способа изобретения, представляет собой соль третичного амина соль трибутиламмония, или соль четвертичного аммония соль тетрабу.тиламмомия, 8 другом предпочтительном аспекте способа изобретения, используемым в стадии (2) ангидридом. является ангидрид алкановой кислоты, содержащей 2-10 С-атомов, предпочтительно. 4-10, особенно 4 или 6

С-атомов. Апротонный полярный растворитель, в котором осуществляется стадия (2) способа изобретения, предпочтительно может быть выбран иэ группы, включающей диметилформамид, гексаметилфосфортриамид, пиридин, или еще смесь этих растворителей друг с другом или с дихлорметаном, и катализатор выбирается в группе, образованной аминами, такими, как пиридин, и диметиламинопиридин.

1831487

Предназначенным для нейтрализации кислотности основанием может быть пиридин (который может служить одновременно растворителем, катализатором и основанием), триэтиламин или трибутиламин.

Предпочтительно, диализ, осуществляемый в стадии (4), проводится в присутствии слабого основания, такого, как бикарбонат натрия, чтобы удалить возможные вторичные продукты, такие, как ангидриды.

Продолжительность реакции может меняться в зависимости от желательной степени ацилирования, например, 1 — 24 ч.

Соединения изобретения,- селективно

О-ацилированные,обладают ин виво пролонгированной активностью. Например, когда эти соединения представляют собой соединения гепаринового типа, обладающие участком связи с А Т III, и следовательно, способны проявлять антитромботическую активность, то эта активность четко пролонгирована во времени по сравнению с таким же соединением, не подвергнутым селективному О-ацилированию, Селективно О-ацилированные гепариновые производные, согласно изобретению, имеющие или нет участок связывания с AT П1, причем эти последние практически лишены антикоагулирующей активности, обладают также различными биологическими активностями, а именно: — ингибирование пролиферации гладких мышечных клеток, которое представляет большой интерес для избежания рецидивов стеноза при вмешательствах, таких, как ангиопластика, обходы и сшивка вен и артерий, трансплантация органов, в особенности трансплантации сердца: — ингибирование гепариназы и гепаритиназы, ферментов, принимающих участие в метастазных диссеминированиях; — противовирусные свойства, в особенности по отношению к ретро-вирусу, а именно по отношению к различным НУ(вирус человеческого иммунодефицита), что представляет большой интерес при лечении СПИДа. — свойства ингибирования лейкоцитарной эластаэы, повышения имеющегося процента ингибиторов эластазы, также как селективного ингибирования синтеза коллагена типа III и фибронектина, что представляет большой интерес для лечения заболеваний, в которых наблюдается нарушение равновесия системы эластазантиэластаза, таких, как эмфизема, также для лечения дегенеративных заболеваний инъюнктивной ткани, таких, как артериосклерози диабет.

Селективно-0-ацилированные глюкоэминогликаны изобретения. следовательно, могут образовывать действующее начало лекарств большого интереса в многочисленных показаниях.

Изобретение также позволяет получить биологические объекты (селективно О-ацилированные глюкозаминогликаны), которые могут быть использованы в качестве стандартов или этанолов в сравнительных изучениях для исследований отношений структура/активность в различных физио10 логических системах, в которых могут содержаться глюкозаминогликаны.

Изобретение будет лучше понятно с помощью нижеследующих примеров.

15 Пример 1. Получение О-ацетилированного гепарина (1С 1938) из тетрабутиламмониевой соли гепарина. а) Получение тетрабутиламмониевой соли гепарина

20 Натриевую соль гепарина (10 г) растворенную в воде (500 мл), перколируют через колонну с катионообменной смолой (Dowex

50 W х 4., в форме Н ); Полученный раствор нейтрализуют гидроксидом тетрабути25 ламмония, После лиофилизации получают тетрабутиламмониевую соль гепарина (19,55 г). б) Ацитили рова н ие:

1,05 г Тетрабутиламмонийгепарината растворяют в безводном диметилформа30 миде (5 мл), После охлаждения до 0 С прикапывают уксусный ангидрид (1 мл:

10:46 ммоль), затем триэтиламин (1,45 мл, 10:46 ммоль) и диметиламинопиридин (64 мг, 0,5 ммоль). Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре. После добавления воды (5 мл), раствор диализуют в течение 72 ч против дистиллированной воды. Тетрабутиламмониевую соль и ревраща40 ют в натриевую соль пропусканием через смолу Dowex 50, Н+, при 0 С, с последующей нейтрализацией.1н. раствором гидроксида натрия. После лиофилизации получают 0,49 г гепарината натрия, селективно 0-ацетили45 рован ного и имеющего следующие характеристики.: соотношение сульфат/карбоксил: 2,28 мэкв/г (исходный продукт 2,20 мэкв/г).

Титр APTT: 91 nllìã

50 C-ЯМР-спектр (метанол. 51,6 м,д., 1з. внутренний стандарт): сигнал при 23,4 м„д.: СНз от СНзСОО; сигнал при 24,5 м,д.: (слабый): СНз от СНзСО-NH- (идентичен исходному продукту), 55 ЯМР-спектр указывает на наличие около двух ацетильных групп на дисахаридную единицу.

Пример 2. Получение 0-ацетилированного гепарина (IC 1938) из трибутиламмониевой соли гепарина.

1831487 а) Получение трибутиламмониевой соли гепаринэ:

Натриевую соль гепаринэ.(10 r) раство- ряют в воде (500 мл), затем перколируют через колонну с катионообменной.смолой 5 (Dowex 50 W х 4, в Н -форме). Раствор нейтрализуют добавлением 10$-ного раствора трибутиламина в зтаноле. После промывки и лиофилизации, получают тетрабутиламмониевую соль гепарина (14,77 г). 10 б) Ацетилирование

К охлажденному до 0 С раствору вышеуказанной соли(4 г) в безводном диметилформамиде (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (250 мг), уксусный 15 ангидрид (3,9 мл) и трибутиламин (9,7 мл).

После выдерживания 24 ч при комнатной температуре, добавляют воду(1,5 мл). Смесь затем выливают в насыщекный раствор э зтаноле ацетата натрия. После промывки 20 этанолом, осадок растворяют в воде, после чего диализуют против 57-ного бикарбокатэ в воде, затем против воды. После лиофилизации получают гепаринат натрия, который О-ацетилирован (1,81 i), - 25

ИК-спектр имеет сильную полосу, относимую к сложному эфиру, при 1730 см, После омыления, продукт имеет: соотношение сульфат/карбоксил

2,38 мэка/г (исходный продукт; 2,40 мэка/r), 30 — титр АРТТ: 85 и!/мг, Пример .3. Получение О-ацетилированного гепарина (IC 1938), используя катализ пиридином, Тетрабутиламмониевую соль гепарина 35 (0,58 r) растворяют в смеси (1/1 от объема) пиридина и диметилформамида (10 мл). Добавляют уксусный ангидрид (О 5 мл). затем смесь выдерживают при комнатной температуре, Спустя 24 часа добавляют водный 40 раствор ацетата натрия (1М, 15 мл), затем смесь выливают в этанол (80 мл) охлажденный до 0 С. После центрифугировэния осадок растворяют в воде (10 мл), затем добавляют этанол (160 мл), э после него- 45 водный ацетат натрия (1М, 10 мл), Осадок затем обрабатывают водной и лиофилизуют, получая О-ацетилированкый гепарин (0,22 r).

П р и м. е р 4. Получение О-пропионили- 50 рованного гепаринэ (! С 1939) с различными степенями пропионилирования.

К охлажденному до 0 С раствору гепе-. . рината тетрабутилэммония (1,85 г), полученному как описано в примере 1, в 55 диметилформамиде (10 мл) прикапывают пропионовый ангидрид (2,1 мл), затем триэтиламик (2,9 мл) и диметиламинопиридин (128 мг). Во время 1 ч, 2 ч, 4-ч, 8 ч и 24 ч отбирают часть реакционной смеси. разбэв ляют равным объемом воды и диализуют в течение 24 ч в дистиллированной воде, После пропускания через смолу Dowex 50, Н . и нейтрализации раствором гидроксида натрия, полученные продукты лиофилизуют и они имеют характеристики, представленные в табл.1.

ПМР-спектр продуктов зарегистрирован в воде с 3,3,3-триметилсилилпропионатом (ТСП} в качестве внутреннего стандарта. Он имеет сигналы при: 1,1 м.д. и

2,4 м.д., характерные относительно остатков СНз и СН2. СНз-СН2-СО-О, и сигналы

5-5 м.д., характерные для протонов озидиевого скелета.

Сравнение интенсивности сигналов припиолила и скелета между обработанным.в течение 1 часа продуктом и таковым, подвергнутым- в течение 24-х часов реакции, иллюстрирует влияние продолжительности реакции. в самом деле, наблюдают. уменьшение сигналов протонов скелета, что указывает на увеличение степени замещения.

С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д., внутренний стандарт), имеет сигналы при

10,8 и 30 м.д„характерные для радикалов

СНз и СНз пропионатов.

Пример 5. Получение О-бутилированкого гепарина (fC 1940) .. А) Использование тетрабутиламмониевой соли гепарина:

К раствору соли тетрабутиламмония гепарина (0.55 г), полученной как описано в примере 1, в диметилформамиде (5 мл) добавляют при 0 С масляный ангидрид и диметиламинопиридин. После выдерживания

24 ч при комнатной температуре, добавляют воду (5 мл), затем реакционную смесь диализуют в течение 12 ч против дистиллированной воды. После пропускания через ионообменник Орех 50, Н+, нейтрализации раствором гидроксида натрия и лиофилизации получают О-бутилированный гепарин в форме соли натрия (0,32 г).

Соотношение сульфат/карбоксил:

2,15 мэкв/г(исходный продукт: 2.20 мэка/г), Титр АРТТ: 59 nl./ìr.

ПМР-спектр(ТСП в качестве внутреннего стандарта) показывает наличие сигналов при 0,9 м.д„1,6 м.д, и 2,4 м.д., характерные для групп СНз-СНз из СНз-СНг-СНт-CO-О-, и сигнэлы между 3 и 6 м.д., характерные для озидиевого скелета.

Анализ ЯМР-спектра указывает на нали-. чие около. одной бутирильной цепи на дисахэридную единицу.

Б) Использование трибутиламмониевой джоли гепарика:

18

1831487

17 диметиламинопиридин. После стояния 24 примере 1, в диметилформамиде (5 мл), добавляют, при 0 С, капроновый ангидрид(1 мл, 6 ммоль), триэтиламин (0,84, мл, 6 ммоль) и диметиламинопиридин. Спустя 24 часа стояния при комнатной температуре добавляют воду (5.мл), затем реакционную смесь часа. при комнатной температуре добавляют воду (5 мл), затем реакционную смесь диа30 лизуют в течение 72-х часов против 5 -ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионообмена на смоле Dowex 50, Н, нейтрализации раство35 ром гидроксида натрия и лиофилизации, получают .О-деканоилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 г).

RMP-спектр (ТСП в качестве внутреннего стандарта} имеет два сигнала при 0,8, 1,2, 40 1,5 и 2,4 м,д, характерные для СНз и СН2 от

СНз-(СН2)анСO-О-.

Б) Использование трибутиламмониевой диализуют в течение 72 ч против 5 -ного раствора бикарбоната, затем против дистиллированной воды. После ионнообмена . на смоле Sowex 50, Н, нейтрализации раствором гидроксида натрия и лиофилизации, получают О-гексаноилированный гепарин в форме натриевой соли (0,30 r).

Титр АРТТ: 25 и1! мг

ПМР-спектр (TCfl, внутренний стандарт), показывает сигналы при 0,8; 1,2, 1,5 и

2,3 м.д. характерные дл я СНз-СН2 из

СНз(СН2)в-СО-О-.

Б) Использование трибутиламмониевой соли гепарина:

К охлажденному до 0 С раствору гепарината трибутиламмония (4 г), полученного как описано в примере 2, в диметилформами- 50 де (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (0,25 r), трибутилвмин (9,7 мл) и ангидрид гексановой кислоты (10,6 мл). Спустя 24 часа, стояния при 20 С, добавляют воду (1,5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натрия 55 в этаноле. После промывки этанолом, диализа и лиофилизации, получают О-гексаноилизированный гепарин (2,5 г).

Пример 7. Получение О-октаноилированного гепарина (1С 1942). соли гепарина.

К охлажденному до 0 C раствору трибу45 тиламмонийгепарината (4 r), полученного как описано в примере 2, в диметилформамиде (50 мл), добавляют диметиламинопиридин (0,25 г), ангидрид декановой кислоты (13,3 г), растворенный в 20 мл диметилформамида) и трибутиламин (9,1 мл). После стояния 24 часа при комнатной температуре, добавляют воду (5 мл), затем насыщенный раствор ацетата натрия в этаноле. Осадок растворяют в диметилсульфоксиде, затем диализуют против воды, бикарбоната натрия и снова воды. После лиофилизации, получают О-деканоилированный гепарин (2,38 г).

Пример 9. Получение О-олеоилироааннего гепарнна (IC 20\3).

К охлажденному до 0 С раствору трибу- . К охлажденному до 0 С раствору гепатиламингепарината (4 г), полученного как рината трибутиламмония (4 г), полученного описано в примере 2, в диметилформамиде как описано в примере 2, в диметилформа(50. мл), добавляют диметиламинопиридин, миде (50 мл), добавляют диметиламинопи(0,25 г), масляный ангидрид (6,7 мл) и трибу- 5 ридин (0,25 г), ангидрид октановой кислоты тиламин (9,7 мл). Оставляют реакционную (12н1 мл) и трибутиламин (9,7 г), Спустя 24 смесь на 24 часа при комнатной температу- часа стояния при комнатной температуре, ре. Добавляют воду (1,5 мл), затем, спустя добавляют воду, затем, спустя 30 минут, на30 минут, насыщенный раствор ацетата на- сыщенный раствор ацетата натрия в этанотрия в этаноле (250 мл). Осадок затем про- 10 ле. После диалиэа против 207-ного мывают три раза этанолом, затем раствора ацетата натрия в этаноле, затем диализуютпротив57-ного растворабикар-. против дистиллированной воды, и ультрабоната, затем против воды. Получают, после фильтрации, продукт подвергают катионнолиофилизации, натриевую canb О-бутилиро- му обмену путем пропускания через смолу ванного гепарина (2,1 г). 15 Оо мех 50, Н, с последующей нейтрализаТитр АРТТ: 29 п!/мг цией гидроксидом натрия. После лиофилиПосле омыления сложных эфиров 0,5 М зации получают О-актаноилированный раствором гидроксида натрия в течение 2 гепарин (2,5 г). часов при ООС, полученный продукт имеет со- Пример 8. Получение О-деканоилиотношение сульфат/карбоксил 2,36 мэкв/г 20 рованного гепарина(IC 1943). (2,40 мэкв/г в исходном продукте). А) Использование тетрабутиламмониеПример 6. Получение О-гексанаили- вой соли гепарина, рованного гепарина (1С 1941). К раствору тетрабутиламмониевой соли

А) Использование тетрабутиламмоние- гепарина (0,55 г), полученной как описано в вой соли гепарина: 25 примере 1, в диметилформамиде (5 мл), при

К раствору тетрабутиламмониевой соли 0 С добавляют капроновый ангидрид (1 мл, гепарина (0,55 г), полученной как описано в 6 ммоль), триэтиламин (0,84 мл, б ммоль) и

1831487

Трибутиламмониевую соль гепарина (3 г) и N,N-диметиламинопиридина (244 r) растворяют в безводном диметилформамиде (50 мл). После охлаждения до. О С, прикапывают олеиновый: ангидрид (21 r) в виде рас- 5 твора в дихлорметане (20 мл), затем трибутиламин (9,5 мл), Спустя 24 часа реакции и охлаждения при 0 С, вводят 5$-ный бикарбонат натрия (10 мл), затем, спустя час, насыщенный спиртовой раствор ацета- 10 та. натрия. Ilocne промывки абсолютным этанолом, растворения в смеси диметилсульфоксида с водой (4/1, по обьему, 750 мл), диализуют против водного 10 -ного этанола, в течение 2-х дней, затем против 15 воды в течение 3-х дней. Натриевую соль олеоилированного гепарина выделяют, после лиофилиэации и осаждения в диэтиловом. эфире лиофилизата, снова растворенного в

ДМФ (2,77т). Содержание олеиновой кисло- 20 ты: 1,44 мкмоль/мг.

Пример 10. Получение 0-бензоилированного гепарина (IC 1944).

Тетрабутиламмониевую соль гепарина,. полученную как описано в примере 2, бен- 25 зоилируют с помощью бензойного ангидрида в условиях, описанных выше для получения О-деканоилированного гепарина (пример 8) ЯМР- С-спектр полученного продукта имеет сигналы при 131, 132 и 136 30 м.д., характерные для бензоильных групп.

Продукт лишен антикоагулирующей активности ин витро.

П р и м е.р 11. Получение О-3-циклопентилпропионилированного гепарина (IC 35

2014).

Ангидрид 3-циклопентилпропионовой кислоты получают после- присоединения кислоты (23 мл, 150 ммоль), в виде раствора в дихлорметане (400 мл), к перемешиваемой 40 и охлаждаемой до -10"С смеси, содержащей тетрабутиламмонийбромид (15 ммоль), 207-ный раствор гидроксида натрия-(60 мл) и дихлорметан (80 мл), и после декантации, промывок 57 — ным бикарбонатом 45 натрия и.водой, и концентрирования в виде масла (96 ). Характеристическая частота в

ИК-спектре: 1800, 1745, 1040 см 1 трибутиламмониевую соль гепарина (4 г) и N,N-диметиламинопиридин (253 мг) растворяют в 50 безводном диметилформамиде (40 мд). Iloсле охлаждения до 0 С прикапывают 3-циклопентилпропионовый ангидрид (11 г), затем трибутиламин (9,8 мл). После 24 ч реакции при комнатной температуре, в затем 55 охлаждения до 0 С добавляют воду(1 мл), и . затем, час спустя, насыщенный спиртовой раствор ацетата натрия. После промывки абсолютным этанолом, осадок диализируют

57,-ным бикарбонатом натрия в течение 24 чаянов, затем водой, в течение 3 дней. После лиофилизации получают О-3-циклопентилпропионил-содержащий гепарин в форме его соли натрия (2,64 г).

ЯМР- С-спектр в 020 (метанол 51,6 м.д., внутренний стандарт), показывает характеристические сигналы при 27,4 м.д.;

31,1 м.д., 34,6 м.д., 35,9 м.д. и 41,7 м.д. группы О-циклопентилпропионил.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,2, Il р и м е р 12. Получение О-ацетилированного гепарина с небольшой молекулярной массой (средняя мол.масса 4500 дальтонов, интервал мол.массы 1800-8000 дальтонов)(1 С 1945).

Этот гепарин с небольшой молекулярной массой получают путем частичной деполимеризации с помощью азотистой кислоты и спиртового фракционирования как описано в европейском патенте 181252 и называют ниже как СУ.216, А) Использование тетрабутиламмониевой соли СУ 216.

Натриевую соль СУ 216(1 г) превращают в тетрабутиламмониевую соль путем пропускания через колонну со смолой Dowex 50, Н+, с последующей нейтрализацией гидроксидом тетрабутил аммония, Таким образом полученную соль (1:7 г) сушат под вакуумом в течение трех часов при 50 С, затем растворяют в безводном диметилформамиде (10 мл). После охлаждения до О С, добавляют уксусный ангидрид (1,7 мл) по каплям, затем триэтиламин (2,4 мл) и диметиламинопиридин (102 мг).

Спустя 20 ч протекания реакции, продукт хроматографируют на колонне с Сефадексом-G 25, элюируя водой. Получают, после конверсии в натриевую соль и лиофилизации, СУ 216 О-ацетилированный (0,89 r), ЯМР- з С-спектр (метанол, 51,6 м.д., как внутренйий стандарт) имеет сигнал при 23 м.д., характерный для ацетатов, Сигнал СНз or СНз-СО-NH- при 24,5 м.д. идентичен таковому исходного продукта.

Соотношение сульфат/карбоксил составляет 2,09 мэкв/г (исходный продукт:

2,05 мзкв/r). — Титр АРТТ: 18 nl/ìr — Титр анти-Ха: 205 п/мг (анализ по Лп и др., J.Lab Gln. Мео) 1973. 81, 298-310).

Б) Использование трибутиламмониевой соли СУ 216;

Натриевую соль СУ 216 превышают в трибутиламмониевую соль путем пропускания через колонну со смолой Oowex 50, Н, затем нейтрализации трибутиламином, как описано для гепарина. Трибутиламмониевую соль СУ 216 получают после промывки

1831487

50 ванной. группы. Соотношение сульфат/карбоксил: 2,08.

Пример 14. Получение О-гексаноилированного гепарина незначительной иолекулярной массы (средняя мол. масса 4500 дальтонов. интервал мол.масс.1800-80Р0 55 двльтонов) (1С 1958).

Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученнуе как описано s примере 12, и

И,М-диметилаиинопиридин (288 иг) растворяют е диметилфориамиде (40 мл). Посев эфиром, лиофилизации и высушивания в су= шильном шкафу под вакуумом.

Вышеуказанную соль(4 г) и.N,N-диметиламинопиридин (288 г) растворяют в диметилформамиде, После охлаждения до ООС, 5 прикапывают уксусный ангидрид (4,4 мл) и затем трибутиламин (11,2 мл). После 24 ч, при комнатной температуре и при охлаждении до 0ОС добавляют воду (1,7 мл), затем, спустя 1 час. насыщенный спиртовой рас- 10 твор ацетата натрия. Осадок промывают этанолом, растворяют в воде, диализуют в течение Зб часов против 5О(,-ного бикарбоната, затем против воды в течение 3 дней.

Получают после лиофилизации ацетили- 15 рованный CY 216 в форме нат риевой соли (1,4 г .

С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при

51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 23 м.д, сигнал, характерный для 20 ацетилированной группы. Соотношение сульфат/карбоксил. 2,07.

Пример 13. Получение О-бутирилированного гепарина незначительной молекулярной массы (средняя мол.масса 4500 25 дальтонов, интервал мол.масс 1800-8000 дальтонов (1С 1957).

Тетрабутиламмониевую соль СУ 216 (4 r), полученную как описано в примере 12, и N,N-диметиламинопиридин (288 мг) рас- 30 творяют в безводном диметилформамиде (40 мл): после охлаждения до 0 С добавляют масляный ангидрид (7,68 мл), по каплям, за- . теи добавляют трибутиламин (11,2 мл); После протекания реакции в течение 24-х 35 часов при комнатной температуре, затем охлаждения до ООС, добавляют воду (1,7 мл), затем, спустя час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натрия. После промывки. этанолом, растворения в апирогенной воде, 40 диализуют против 5 -ного бикарбоната натрия в течение Зб часов, затем против воды в течение 3-х дней: О-бутирилированный СУ

216 выделяют в форме натриевой соли после лиофилизации (2,14 г). 45 С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при

51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15,6 м.д., 20.5 м;д. и 39.4 и.д, сигналы, характерные для О-бутирилироохлаждения до 0 С прикапывают капроновый ангидрид (10.8 мл) и трибутиламин (11,2 мл). После протекания реакции в течение 24-х часов при комнатной температуре, затем охлаждения до 0 С, добавляют воду. (1,7 мл), затем спустя 1 ч насыщенный спиртовой раствор ацетата натрия. После промывки абсолютным этанолом, растворения в апирогенной воде, диализуют против

5 -ного бикарбоната натрия в течение 36 часов, затем против воды в течение 3-х дней, 0-Капроилированный СУ 216 выделяют в форме натриевой соли после лиофилизации (2,5 г .

С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол с

51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет при 1 5,9 м.д., 24,2 м,д., 26,4 м.д., 33,1 м.д. и 36,4 м.д. сигналы,.характерные для капроильной группы.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,08.

П. р и м е р 15. Получение 0-октаноилированного гепарина небольшой молекулярной массы (средняя мол.масса 4500 дальтонов, интервал мол.массы 1800-8000 дал ьтонов) (3C 1959).

Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и

N,N-äèìåòèëàìèíoïèðèäèí (288 мг) растворяют в диметилформамиде (40 мл). После охлаждения до 0 С прикапывают ангидрид каприловой кислоты (14 мл), затем трибутиламин (11,2 мл), После протекания реакции в течение 24 ч при комнатной температуре и охлаждения до 0 С добавляют воду (1,7 мл), затем, спустя час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натрия, После промывки абсолютным этанолом, растворения в апи.рогенной воде; диалиэуют 5 -ным бикарбонатом натрия в течение 36 часов, затем водой в течение 3 дн., получают после лиофилизации, 0-октаноилированный СУ 2 16 в форме натриевой соли (1,76 г). С-ЯМР1З спектр. в ДМСО-de (метанол при 51,6 м,д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 16,8 м.д„25,0 м.д., 27,3 м.д., 30,9 м.д., 31,4, 34,1 и 36,4 м.д., характерные для каприлоильной группы. Соотношение сульфат/карбоксил: 2,07.

fl р и м е р 16. Получение О-деканоилированного гепарина небольшой молекулярной массы (средняя мол,масс 4500 дальтонов, интервал мол.масс 1800-8000 дальтонов) {! С 1960), Трибутиламмониевую соль СУ 216 (4 г), полученную как описано в примере 12, и

И,N-диметиламинопиридин (288 мг) раство- ряют в диметилформамиде (40 мл), После охлаждения до 0 С,.прикапывают ангидрид декановой кислоты (15,3 мл) в виде раствора. в безводном диметилформамиде

1831487 . (10 мл), затем трибутиламин (11,2 мл). После протекания реакции в течение 24 ч при комнатной температуре, и охлаждения до О С. добавляют воду (1,7 мл), затем, спустя час, насыщенный спиртовой раствор ацетата натрия.

После промывки абсолютным этанолом и суспендирования в апирогенной воде, диалиэуют 57ь-ным бикарбонатом натрия в течение 2-х дней, 10ь-ным NaCI в течение

2-х дней, затем водой в течение 5 дней.

О-Деканоилированный СУ 216 выделяют в форме натриевой соли после лиофилиэации (2.76 r).

С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при 16,4 м,д., 22,3 м.д., 25,1 м.д..

29,2 м.д„31,9, 34,4 и 36,5 м.д., характерные для деканоильной группы.

Соотношение сульфат/карбоксил: 2,13.

Пример 17. Получение О-ацетилированного гепарина незначительной молекулярной массы (средняя мол,масс 2500 дальтонов, интервал мол.масс 1500-8000 дальтонов)(! С 1946).

Этот гепарин небольшой молекулярной массы получают путем частичной деполимеризации с помощью азотистой кислоты согласно способу, описанному в европейском патенте 37319, и называют далее СУ 222.

Натриевую соль СУ 222 превращают в трибутиламмониевую соль путем пропускал ния через колонну со смолой Dowex 50, Н . затем нейтрализации трибутиламином, Полученную после лиофилизации соль (1,5 г) растворяют в диметилформамиде (5 мл), затем, после охлаждения до О С, добавляют по каплям уксусный ангидрид (1,35 мл), затем триэтиламин (2 мл) и диметиламинопиридин (85 мг). После протекания реакции в течение 18 ч, добавляют воду (20 мл), затем смесь диализуют в течение

3 дн против дистиллированной воды, После конверсии в натриевую соль и лиофилиэации получают СУ 222, О-ацетилированный (0,86 г), Продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 1,98 мзкв/г (исходный продукт: 1,97 мзкв/r).

ЯМР С-спектр(метанол 51,6 м,д, в качестве внутреннего стандарта) продукта содержит сигнал при 23 м.д., характерный для

О-ацетила, Сравнение интенсивностей сигналов

N-ацетила (при 24,5 м,д,) между исходным продуктом и полученным продуктом показывает; что ацетилирование селективное. — Титр APTT: 8 п1/иг — Титр анти-Ха; 19.1 u/ìl.

Пример 18. Получение фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину III (IC 1772), 1) Разрезание гепариновых цепей с помощью иодной кислоты:

10 г гепарина, инъекцируемого в mucus

de роге, в форме натриевой соли, с титром

157 п!lмг в дозировке Codex и 155 u/ìã в дозировке анти-фактора Ха no Jin и др„ растворяют в 250 мл деминерализованной воды при 4 С; рН раствора доводят до 5,0 с помощью концентрированной соляной кислоты. При умеренном перемешивании добавляют 1О г метапериодата натрия (Na 104, 15 мол.масса: 213,89) в виде раствора в 250 мл диминералиэованной воды при 4 С, рН совокупности доводят до 5,0 с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор выдерживают 24 часа, в темноте, в холод- .

20 ном помещении при +4 С.

2) Элиминирование остаточного периодата:

Затем реакционный раствор размещаloT e три диализных рукава (пористость 3

25 4.000 Ра) и подвергают его диализу в течение 15 ч против проточной деминерализованной воды, 3) Деполимеризация в основной среде:

К 780 мл полученного после диализа

30 раствора добавляют 16 мл 10 .н. раствора гидроксида натрия, и всю совокупность подвергают перемешиванию в течение 3-х часов при комнатной температуре (порядка

18 — 21 С).

4) Восстановление:

500 мг Боргидрида натрия NaBH4, (мол,масса: 37,83) добавляют после этого и раствор перемешивают снова 4 ч при комнатной температуре. его рН затем доводят

40 до 4 с помощью концентрированной соляной кислоты, После перемешивания в течение 15 мин .рН доводят до 7 с помощью концентрированного раствора гидроксида натрия, К 820 мл таким образом полученного раствора добавляют 16,4 г NaCI, затем 1270 мл этанола. Всю совокупность оставляют стоять в течение 3 ч, затем центрифугируют при 2500 об/мин, в течение 20 мин. Осадок

50 собирают. суспендируют снова его в 200 мл чистого этанола, размельчают и окончательно рекупирируют фильтрацией на воронке

Бюхнера. После этого высушивают под вакуумом при 40 С в течение 5 ч. Получают

55 таким образом 8,9 г продукта.

5) Спиртовое фракционирование :

Эти 8,9 г растворяют примерно в 120 мл деминерализованной воды при комнатной температуре. Добавляют 1.78 г NaCI и рН раствора снижают до 3,5 с помощью соля25 t 831487 ной кислоты. Объем раствора доводят до

178 мл с помощью деминерализованной воды, 151 мл чистого этанола добавляют при перемешивании, Перемешивание продолжают в течение 15 минут после окончания добавления, затем всю совокупность оставляют стоять в течение 10 ч при комнатной температуре.

Образовавшийся осадок получают путем центрифугирования в течение 20 минут при 2500 об/мин. Снова суспендируют в

150 мл чистого этанола, раэмельчают, рекуперируют путем фильтрации на .воронке

Бюхнера, промывают 300 мл чистого этанола, и, наконец, высушивают под вакуумом при 40 С в течение 24 ч.

Таким образом, выделяют в форме порошка белого цвета 5 г продукта tC 1772, обладающего следующими характеристиками: — S03: 3.55 мэкв/г; СОО: 1,54 мэке/г;

S + С: 5,09 мзкв/г; S/С: 2,31 мэкв/г, Он практически лишен N-ацетил-глюкозамина (отсутствие сигнала при 24,5 м.д. на спектр ЯМР- С), 1з — Титр Codex: 11 nt/мг. — Титрр АРТТ: 9 nt/èã — Титр анти-Ха; 12 u/ìã.

Б) Получение О-ацетилированного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину Ill (1С 1924).

Полученный в стадии А) продукт превращают в тетрабутиламмониевую соль путем пропускания через смолу Dowex 50, Н, затем нейтрализации с помощью гидроксида тетрабутиламмония, Из 9,5 r натриевой соли получают 18 г соли тетрабутиламмония.

К раствору 6 г таким образом полученной соли, в диметилформамиде (55 мл), добавляют, после охлаждения до 0 С, уксусный ангидрид (6,2 мл, 5,6 ммоль), затем тризтиламин {9 Mfl, 65,6 ммоль) и диметиламинопиридин (403 мг, 3,3 ммоль). Спустя

24 ч добавляют насыщенный раствор ацетата натрия в зтаноле (250 мл). После центрифугирования и промывки осадкс этанолом, твердое вещество обессоливают на Сефадекса-С-25, затем подвергают ионообмену путем пропускания íà Dowex 50, Н, с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия. После лиофилизации получают продукт lC 1924 (3 г).

Этот продукт имеет следующие характеристики: — соотношение сульфат/карбоксия

2,28 мзкв/г

13

С-ЯМР-спектр (метанол, 51,6 м.д., как внутренний стандарт) ясно показывает, что продукт О-ацилирован. Сигнал, характерный для Сг N-ацетил-глюкозамина, около . 56 м.д., такой же, как в исходном продукте, отсутствует в спектре, Пример t9. Получение О-бутирили5 рованного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину lll (IC 1925).

6 г соли тетрабутиламмония IC 1772, полученной как описано в примере 18, бутирилируют с помощью масляного ангидрида

10 в условиях, описанных для ацетилирования.

Получают продукт IC 1925 {2,96 г), который имеет следующие характеристики: — соотношение сульфат/карбоксил: 2,31 мэка/г

15 Спектр С-ЯМР (метанол; 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) содержит пы при 15,6,20,4 и 38,4 м.д.

Пример 20, Получение О-г1ЯЫЖвлли20 рованного фрагмента гепарина, лишенного сродства к антитромбину И! (IC 1926).

6 r соли тетрабутиламмония IC 1772, полученной как описано в примере 12, обрабатывают:ангидридом гексановой кис25 лоты таким же образом. как для ацетилирования. Получают продукт IC t326 (3 г), который имеет следующие характеристики: — соотношение сульфат/карбоксил: 2,20 мэкв/г

30 С-ЯМР-сйектр (метанол, 51,6 м,д„в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы, характерные для СНз и СН2 гексильной группы при 15,5, 23,9, 26;2, 32,7 и

36,1 м.д.

35 ПМР-спектр указывает на наличие примерно одной гексильной группы на дисахаридную единицу, Пример 21, Получение смеси фрагментов. лишенных сродства к антитромбину

40 И!, гомогенных с точки зрения их молекулярной массы и О-бутирилированных.

Смесь фрагментов, лишенных антикоагулирующей активности, описанных в примере 12,. фракционируют на ее различные

45 составляющие путем гель-фильтрации, Таким образом получают го -,огенные по молекулярной массе фракции, массы которых составляют 7700, 6500, 5800, 5300, 4980, 4400, 3900, 3400, 2600, 1860 и 1210.

50 Пример этерификации фракции:

Фракцию с массой 2600 (0,20 г) превращают в соль трибутиламмония, затем лиофилизируют и высушивают (0,34 г). Этот . продукт затем растворяют в ДМФ (2 мл), 55 затем последовательно добавляют дизтиламинопиридин (18 мг), масляный ангидрид (0,49 мл) и трибутиламин (0,7 мл), после охлаждения до 0 С. После выдерживания 24 часа при комнатной температуре, добавляют бикарбонат натрия (1 мл 5Я,-ного раство1831487

28 ра), затем через 2 ч, смесь хроматографируют на колонне с Сефадексом С 25 (1 л), элюируя 0,2 М раствором хлорида натрия, Продукт лиофилизируют после обессоливания, получая порошок светло-бежевого цвета (0,24 г).

Другие .фракции обрабатывают таким же образом, получая. соответствующие продукты, MK-анализ которых обнаруживает наличие сложноэфирной полосы.при 1734.см .

-1

Степень сульфатации продуктов (отношение сульфата к карбоксилу, не .изменена после ацилирования.

Определение степени ацилирования:, Ee определяют путем хроматографии s газовой фазе, после бутанолиза продуктов бутано-сернокислотной смесью., затем путем экстракции хлороформом сложных бутиловых эфиров и удаления избыточного метанола промывкой водой.

Пример 22. Получение О-ацетилиро ванного дерматан-сульфата {1C 1947), К охлажденному до ООС растворутетрабутиламмониевой соли дерматансульфата (0,91 r), полученной в тех же условиях, что и таковые, описанные для получения тетрабутиламмонийгепарината в примере 1, в диметилформамиде (20 мл), прикапывают уксусный ангидрид (1,35 мл, 14,2 ммоль), . затем тризтиламин (1,97 мл, 14,2 ммоль) и диметиламинопиридин (0,7 ммоль), Спустя

24 часа выдерживания при комнатной температуре, добавляют воду (40 мл), затем диализуют в течение 72 ч, Натриевую сапь получают путем пропускания через колонну

С Dowex 50., Н ", при 0 С, с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия, Получают, после лиофилизации. порошок бежевого цвета (0,52 г), О-Ацетилированный демантан-сульфат имеет следующие характеристики: — соотношение сульфат/кербоксил .

0,99 мэкв/г (исходный продукт: 1,05 мэке/г)

С-ЯМР-спектр (метанола 51,6 м.д. в

1з качестве внутреннего стандарта), сигнал при 25,2 м.д, СНз от СНз-СОН-NН-(идентичный исходному продукту).

Сигнал при 23,0 м,д, СНз от СНз-CÎ-О, Пример 23. Получение О-сукцинилированного дерматан-сульфата (1С 2020).

Тетрабутиламмониевую соль дерматансульфата (1 r) и N,N-диметиламинопиридин (110 мг) растворяют в безводном диметилформамиде. После добавления янтарного ангидрида (396 мг) и трибутилемине (0,94 мл), среду инкубируют в безводных условиях в течение 2 ч при 60 С, После охлаждения и добавления воды (2 мл) осуществляют осаждение в охлажденном льдом спиртовом растворе, насыщенном ацетатом

25,3 м.д. сигнал, характерный для метила ацетамидной группы, идентичный исходно-. му продукту.

Соотношение сульфат/карбоксил: 0,51.

Пример 24. Получение О-бутирили20 рованного гепарина, предварительно N-десульфатированного и N-ацетилированного (1С 1948).

Гепарин N-десульфатируют, затем Nвцетилируют..

Трибутиламмониевую соль (1 r) получеют путем пропускания через смолу 0оюех

50, Н+, затем нейтрализации с помощью раствора трибутиламина в этаноле, После лиофилизации и высушивания, эту соль растворяют в диметилформамиде

30 (10 мл); затем, после охлаждения до 0 С, добавляют масляный ангидрид(2 мл), трибутилемин (2 мл) и диметиламииопиридин (65 мг). Спустя 24.ч добавляют воду (5 мл), 35 затем смесь диелиэуют против 5%-ного раствора бикербоната натрия, после чего — против воды. После пропускания через Dowex

50, Н с последующей нейтрализацией гидроксидом натрия, получают натриевую соль

О-бутирилированного N-ацетилированного гепарина.

Спектр ЯМР- С (метанол 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта) имеет сигнал при 24,6 м.д., характерный дпя N-ецетила, и.сигналы при 16, 20 и 38 м.д.,характерные для сложных масляных эфиров.

Эксперимент может быть повторен с частично N-десульфатированным N-ацетилированным гепарином и проводить к частично й-десульфатированному й-ацетилированному и О-бутирипированному продукту.

Пример 25. Получение парацетилировенного дерматвн-сульфата (IC 1950).

Тетребутилеммониевую соль дерматен-сульфате (0,8 г), растворенную в диметилформемиде (20 мп), ецетипируют воздействием диметилеминопиридина(76 мг), уксусного ангидриде (1,2 мл) и триэтилемине (1,7 мл). Смесь нагревает при 80 С в. течение 1 ч. натрия. Осадок промывают этанолом, растворяют в пирогенной воде, затем диализуют против 5%-ного бикарбоната натрия в . ечение 36 часов, затем против воды в тече5 ние 3 дн, Получают, после лиофилизации, О.-сукцинилированный дермант-сульфат в форме натриевой соли (0,83 мг), ИК-спектр (КВ) имеет. при 1730 см и

1420 см " частоты, характерные (волновое

10 число) для карбоксильной группы,.

С-ЯМ Р-cfleKTp в Д20 (метанол 51,6 м.д, в качестве внутреннего стандарта) имеет сигналы при ЗЗ, 34,5 и Ф83,6 м.д.. характер.ные для сукцинильной группы, и при

1831487

После возвращения к комнатной температуре, добавляют воду (0,45 мл), затем 0,3 М раствор ацетата натрия в этаноле (100 мл).

После центрифугирования, осадок растворяют в воде, затем диализуют против дистиллированной воды, Натриевую соль получают путем обмена на колонке с Dowex

50, Н, затем путем нейтрализации гидроксидом натрия. Получают; после лиофилизации, перацетилированный дерматансульфат (0,51 г).

Этот продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 1,07 мэкв/г (исходный продукт: 1,05 мэкв/г) и содержит около трех ацетильных групп. на дисахаридную единицу

Пример 26. Получение О-ацетилированного гепарин-бензилового сложного эфира (1С 1949).

К раствору тетрабутиламмонийгепарината (1 r) в диметилформамиде (10 мл) добавляют бензилбромид (0,17 мл). Спустя 24 часа выдерживания при комнатной температуре, добавляют тетрабутиламмонийацетат (220 мг), Спустя 24 ч, осуществляют ацетилирование образовавшегося сложного бензилового эфира, Для этого, вводят диметиламинопиридин (57 мг), затем триэтиламин (1,3 мл) и уксусный ангидрид (0,9 мл).

После возвращения к комнатной температуре реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч. Тогда добавляют воду, затем продукт осаждают насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. После диализа против дистиллированной воды, пропускание через Dowex 50, Н, нейтрализации гидроксидом натрия и лиофилизации, получают натриевую соль О-ацетилированного сложного бензилового эфира гепарина (0,57 r).

Продукт имеет соотношение сульфат/карбоксил 3,6 мэке/г (исходный продукт не бензилированный: 2,20 мэкв/г), 1э

С-ЯМР-спектр (метанол. 51,6 м.д., в качестве внутреннего стандарта) имеет еигналы при 23,3 м.д. (О-ацетил) и при 131,6 м.д. (бензил).

Сигнал СНз от СНз-СО-NH при 24,5м.д. идентичен таковому исходного продукта.

Пример 27. Получение О-ацетилированного беизилового эфира дерматансульфата (IC 1953), Тетрабутиламмониевую соль дерматансульфата (1 г) растворяют в безводном диметилформамиде (15 мл). K этому раствору, охлажденному до 0 С, добавляют бензилбромид (О;25 мл), затем оставляют стоять в течение 24 ч при комнатной температуре..

55 (220 мг) растворяют в безводном диметилформамиде (25 мл). После охлаждения до

0 С, прикапывают ангидрид гексановой кислоты (9,4 мл), затем трибутиламин (8,6 мл). После выдерживания 24 ч при комнатной температуре и охлаждения до 0 С, добавления воды (1 мл), осуществляют осаждение в ледяном спиртовом растворе,. насыщенном ацетатом натрия. Осадок про- . мывают абсолютным этанолом, растворяют в апирогенной воде и диализуют против 5О,Тетрабутиламмонийацетат (0,32 г) затем добавляют, после чего, спустя 24 часа при комнатной температуре, осуществляют ацетилирование.

5 Вводят уксусный ангидрид (1,5 мл), затем триэтиламин (2,2 мл).и диметиламинопиридин (96 мг); Спустя 24 ч добавляют воду (0,6 мл)„затем продукт осаждают добавлением насыщенного этанольного раствора

10 ацетата натрия.

Продукт диализуют против 107ь-ного хлорида натрия, затем против воды.

Получают, после лиофилизации, сложный бензиловый эфир 0-ацетилированного

15 дерматан-сульфата (0,63 г).

Пример 28, Получение О-бутирилированного дерманат-сульфата (IC 2018).

Трибутиламмониевую соль дерматансульфата(2 г), полученную в тех же условиях, .

20.что и таковые, описанные для получения трибутиламмонийгепарината в примере 2, и

N,N-диметиламинопиридин (220 мг) растворяют в безводном диметилформамиде (25 мл). После охлаждения до 0 С прикапы25 . вают масляный ангидрид (5,9 мл), затем трибутиламин:(8,6 мл), После инкубации в течение 24-х часов. и охлаждения до 0 С добавляют воду (1 мл); осаждение проводят в спиртовом, охлажденном льдом, рас30 творе. насыщенном ацетатом натрия, Осадок промывают этанолом, растворяют в апирогенной воде и диализуют против 5;(ного бикарбоната натрию в течение 36 часов, затем против воды в течение 3-х дней.

35 Получают, после лиофилизации, О-бутирилированный дерматан-сульфат в виде натриевой соли (1,3 г).

1З

С-ЯМР-спектр в Д20 (метанол при

51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта)

40 имеет при 15,6; 20,5 и 38,4 м.д. сигналы, характерные для бутирильной группы, и при

25,2 м,д. сигнал, характерный для метила ацетамидо-группы идентичный исходному и роду кту.

Соотношение сульфат/карбоксил: 1,05.

Пример 29. Получе. ие О-гексаноилированного дерматан-сульфата (IС 2019).

Трибутиламмониевую соль дерматансульфата (2 г) и N,N-диметиламинопиридин

1831487 ного бикарбоната натрия в течение 36 часов, затем против воды в течение 3 дн, Получают после лиофилизации О-гексаноилированный дерматан-сульфат в виде натриевой соли(1 г).

1З

С-ЯМР-спектр в Д20 (метанола при

51,6 м.д, в качестве внутреннего стандарта) имеет при 15,9, 24,2, 26,5, 33,1 и 36,4 м.д., сигналы, характерные для О-гексаноилированной группы, а при 25,2 м.д. сигнал, харак5

10 терный для метила ацетамидной группы, идентичный исходному продукту.

Соотношение сульфат/карбоксил: 1,02. . Пример 30. Осуществление селективного О-ацетилирования по способу иэобретения и сравнения с другими способами ацетилирования.

Способ настоящего изобретения сравнивается.со способами патента Франции

М 2100735 и европейского патента 256880

В особенности, характеристики сложного уксусного эфира гепарина, полученного по способу изобретения IC 1938, пример 1, сравниваются с таковыми сложного уксусного эфира гепарина, полученного при применении условий работы, описанных в патенте Франции 2100735 (продукт А), и сложными уксусными эфирами гепарина, полученными по способам работы приме30 ров 3 и 4 европейского патент 256880 (продукты В и С). (а) Получение продукта А

В раствор тетрабутиламмонийгепарината (1 г), растворенного в безводном диметилформамиде (10 мл), вводят дициклогекси- 35 лизации гидроксидом натрия. Получают

0,493 г продукта А. 50

Это приготовление также реализуют в течение 48 ч при +4ОС. (б) Получение продуктов.В и С.

Продукты В и С получают путем ацетилирования гепарина в смеси формамида с пиридином с помощью ацетилхлорида. используя 2 мл ацетилхлорида для продукта В и 40 мл для продукта С в условиях, описанных в примерах 3 и 4 европейского патента лкарбодиимид(4,2 r), растворенный в диметилформамиде (15 мл); затем уксусную кислоту (1,16 мл), растворенную в диметилформамиде (25 мл) прикапывают в течение

45 мин при+4 С. 40

После.выдерживания 24 часа при комнатной температуре, реакционную смесь . фильтруют и концентрируют под вакуумом.

Остаток снова суспендируют в эфире. После фильтрации и промывки, осадок диалиэуют. 45 против дистиллированной воды, Натриевую соль получают путем пропускания через колонну со смолой 0оиех Н+, затем нейтра256880, Уксусный эфир затем растворяют в воде и диализуют против хлорида натрия. (в) Результаты

Характеристики продуктов даны в табл.2, .Характеристика исходного .гепарина, используемого в каждом опыте, дана в качестве ссылки. .Результаты показывают, что, хотя титры

APTT и 3W ниже для всех продуктов, чем таковые исходного гепарина, и это более сильно выражено для продуктов А, В и С, только один продукт 1С 1938 сохраняет соотношение сульфат/карбоксил практически идентичным таковому исходного гепарина.

Зто указывает на то. что способ изобретения позволяет селективно ацилировать гидроксильные функции без затрагивания функциональных групп гепарина, что подтверждается химическим анализом продуктов, Продукты fC 1938, А, В и С проанализированы с помощью С-ЯМР(метанола с 51,6 м.д. в качестве внутреннего стандарта).

Спектры этих продуктов, также, как таковой исходного гепарина, даны в следующем виде:

Фиг, 1: исходный гепарин

Фиг, 2: IC 1938

Фиг. 3; продукт А после реакции в течение 24 ч

Фиг. 4: продукт А после реакции в течение 48 ч . Фиг. 5: продукт В

Фиг. 6: продукт С.

Результаты следующие:

1, Продукт iC 1938 имеет в спектре углерода (фиг.2); сигнал при 23,4 м.д., соответствующий СНз из СНз-СО-О.сигнал при 24,4 м.д., соответствующий СНз иэ СНз-СО-NH, идентичный сигналу, имеющемуся в исходном гепарина.

Зти сигналы показывают, что аминные и карбоксильные группы не затрагиваются и что происходит селективное ацетилирование на уровне гидроксильных групп.

2. Анализ продукта А С-ЯМР-спектро1з скопией показывает, что полученный в большинстве продукт, также хорошо спустя 14 часа, как и после 48 ч(фиг.3 и 4) представляет собой изомочевинное производное гепарина, карбоксильные функции которого замещены группой: вследствие использования дициклогексилкарбодиимида.. В самом деле, наблюдают значительные сигналы, соответствующие атомам углерода вышеуказанной группы при 28; 34, 54 и 156 м.д., тогда как сигнал, 33

1831487 соответствующий СНз иэ СНэ-СО-О при

23 м.д, очень слабый.

Следовательно, способ не позволяет получать селективное О-ацилирование карбоксильных функций, что отражает увеличение соотношения сульфат/карбоксил, 3. Продукт В имеет в углеродном спектре (фиг.3); — сигнал при 23,1 м.д„соответствующий

С Нз из С Нз-СО-Π— сигнал при 24,8 м.д., соответствующий

СНэ из СНэ-СО-NH, четко более интенсивные чем таковые исходного гепарина и 1С

1938.

Эти сигналы показывают, что наблюдают не только О-ацетилирование, но и также сильное N-ацетилирование. Используемый способ ацилирования, который не селективный, вызывает частичную П-десульфатацию, с последующим ацетилированием аминов, что также вызывает уменьшение соотношения сульфат/карбоксил, что также вызывает уменьшение соотношения сульфат/карбоксил, 4. Продукт С имеет в углеродном спектре: — сигнал при 22 м,д., соответствующий

СНэ из СНэ-СО-Π— сигнал при 24 м.д., соответствующий

СНэ из СНэ-СО-NH, четко более интенсивные, чем таковые исходного гепарина и 1С

1938, Как и для продукта В, наблюдают сразу

О- и N-ацетилирование, N-десульфатация, более значительная; чем для продукта В. вызывает сильное уменьшение соотношения сульфат/карбоксил, Фармакологическая активность продуктов изобретения

А) Антикоагулирующая активность ин витро:

1. Оценка титра ин витро по отношению к gamme.-эталону:

Это измерение осуществляют с помощью теста "время цефалина, сенсибилиэированного каолином" (Франция), на человеческой плазме. Результаты даны в табл.3.

Полученные результаты показывают, что селективно О-ацилированные продукты изобретения имеют титр ин витро ниже такого гепарина, их антикоагулирующая ак-. тивность уменьшается, когда возрастает длина ацилирующей цепи.

2. Измерение антикоагулирующей активности инвитров продуктов изобретенЬя на человеческой крови:

Опыты осуществляются с двумя дозами продуктов изобретения: 2 м кг/мл и 4 мкг/мл, на 5 мл человеческой крови, Контрольный

30

40 уменьшение "amx" и IPT, что соответствует увеличению гипокоагуляции. Эта гипокоагу45

55

15 опыт также осуществляется для каждого продукта, заменяя испытуемый продукт изотоническим раствором NaCI. После инку:бации 30 мин при комнатной температуре, кровь центрифугируют в течение 20 мин при

3000 об/мин, Лишенную тромбоцитов плазму декантируют, чтобы реализовать следующие тесты: — ТСК (время Цефалин-Каолина) — Гептест я

Результаты даны в табл.4. Каждый ре1 зультаты соответствует среднему из трех опытов.

Результаты показывают в обоих методах удлинение времени коагуляции для про-. дуктов 1С 1940 и 1С 1941. Это удлинение пропорционально дозе, Взамен, в этих методах ин витро, продукт 1С 1943 показывает только очень незначительное воздействие на удлинение времени коагуляции.

3., Измерение антикоагулирующей активности ин витро продуктов изобретения путем тромбозластографии на человеческой крови:

Продукты изобретения, при дозах 2 мкгlмл и 4 мкг/мл, испытывают на 5 мл человеческой крови, как описано в предыду-. щем испытании, причем контроль реализуют для каждого продукта, заменяя испытуемый продукт на изотонический раствор NaCl.

После инкубации 30 мин при комнатной температуре, тромбоэластографический отпечаток реализуют с помощью тромбоэластографии Не!И9е на 0,25 мл крови, рекальцифированной с помощью 0,1 мл 0,058 М

CaClz, Результаты даны в табл.5.

Результаты показывают, что 1С 1940 и

1С 194 1 вызывают увеличение "r" и "k", ляция возрастает сразу в зависимости от используемой дозы и длины ацилирующей цепи, 1С 1943, в этом тесте, не вызывает заметной модификации параметров

Б),Антикоагулирующая активность ин виво.

1) Измерение антикоагулирующей активности ин вивов продуктов изобретения у кролика (внутривенно):

Опыты осуществляются на самцах новозеландских кроликов. Отбор крови осуществляют на уровне медиальной артерии уха перед иньекцией продукта.

Затем. в краевую вену уха вводят. путем инъекции раствор испытуемого продукта в количестве 25 мг продукта в 5 мл изотоничвского раствора:йаС1.

1831487

Тест ТСК и HEPTEST реализуются на крови, отобранной перед инъекцией продукта, и .отборах крови, осуществленных спустя 6, 24, 48 и 96 ч после инъекции.

Результаты даны на фиг,7 и 8. Они показывают чистое удлинение во времени антикоагулирующей активности, причем это удлинение увеличивается с длиной ацилирующей цепи, В самом деле, антикоагулирующая активность продукта IC 1940 еще отчетливая плюс 6 ч после инъекции, тогда как она еще отчетливая спустя 24 ч после инъекции для продукта 1С 1941 и она пролонгируется вплоть до 96 ч для продукта 1С

1943.

2. Измерение антикоагулирующей активности ин вива продуктов. изобретения путем тромбоэластографии:

Испытуемые продукты вводят путем инъекции внутривенно как описано в предыдущем опыте (25 мг в 5 мл изотонического раствора NaCI). Тромбозластографический отпечаток реализуют с помощью тромбоэластографа Hellige на 0,25 мл образцов крови, отобранных перед инъекцией, и спустя 6, 24, 48 и 96 ч после инъекции, причем дополнительные отборы осуществляются, когда антикоагулирующая активность длится сверх

96 ч. Результаты даны в табл. 6,7 и 8.

Полученные результаты показывают, что для всех продуктов отмечается сильное увеличение "r" + "k" и уменьшение IPT на

6-ом часу, что указывает на удлинение гипокоагуляемости, Она пролонгируется вплоть да ho крайней мере 24 ч после инъекции для продукта IC 1941 и еще измерима 96 ч спустя после инъекции для продукта IC 1943.

Следовательно, констатируют, что все продукты имеют сильную антикоагулирующую активность ин виво, что эта активность пролонгирована во времени и что !С 1943,. который только мало или вообще неактивен в опытах ин витро, оказывается очень активным и сильно пролонгирован а опытах ин вйво, 3. Антикоагулирующая активность продуктов IC 1945, IC 1957 и IC 1958. полученных соответственно примерам 12, 13 и 14, испытывается ин вива у кролика.

Результаты показывают удлинение.фармакокинетики при введении продуктов внутривенно и подкожно, в отношений продуктов IC 1957 и IC 1958, В) Активность на модели ин витро ингибирования вирусов HIV-1 и -2:

Продукты, полученные согласно изобретению, испытываются на модели ингибирования вирусов HIV-1 и HIV-2 ин витро.

Все испытуемые продукты становятся активными при дозах, полностью лишенных

15

20 бирования различных покравных вирусов

Активность продуктов, полученных со25 гласно изобретению,.по отношению к инги40 продуктово клеток, 45 Продукты, полученные согласно изо30

55 цитотоксичности. В особенности, констатируют, что продукты IC 1925 и IC 1926 более активны, чем исходный продукт.

Г) Активность на модели ин витро ингибирования образования ЯупсЮа

Syncltla представляет собой гигантские клетки, с многими ядрами, образуемые путем слияния здоровых лимфоцитов Т 4 и инфицированными лимфоцитами Т4, Продукты, полученные согласно изобретению, испытываются на модели кокультуры клетки. MOLT 4 (здоровые лимфоциты Т4) и клеток HUT-78/HT Ч III В (инфицированные лимфоциты Т 4 человечас кой линии).

Все испытуемые продукты оказываются активными в этой модели, при дозах, полностью. лишенных цитотоксичности. В частности, продукты IC 1924, IC 1925 и IC 1926 найдены более активными, чем исходный прадукт.

Д) Активность в модели ин витро ингибированию различных покровных вирусов с

ADN или ARN, в особенности следующих вирусов: — HSY 1 и 2 (Негрез Simp Lex virus 1 и 2, вирус к ADN) — YSY (Vasicular StomatItIs Virus) вирус

cARN. — Sindbis — вирус

Все испытуемые продукты оказались активными hpN ингибировании этих вирусов, при дозах. лишенных цитотоксичности. В особенности, продукты t C 1924, IC.1925 и IC

1926 обладают сильно увеличенной активностью по отношению к YSY и $ЬбЫз вирусу, вирус с ARN по сравнению.с исходным

Е) Активность в модели ин виво ингибирования пролиферации гладких мышечных бретению, испытываются на модели ингибирования пролиферации гладких мышечных клеток ин виво у крысы (модель катетерного баллона).

Испытуемые продукты оказались активными. В особенности, продукты !С 1924, IC

1925 и IC 1926 обладают возросшей активностью по сравнению с исходным продуктом.

Формула изобретения

1. Способ получения О-ацилированных глюкозаминогликанов, включающий обработку глюкозаминогликанов ацилирующими агентами в присутствии акцептора

1831487

Таблица 1

Таблица 2

* Титры АРТТ и Лп и Wessler измерены ин витро. кислоты, в среде полярного органического растворителя с последующей очисткой целевых продуктов, отл ич а ю щийс я тем, что, с целью обеспечения селективности

О-ацилирования и получения продуктов с воспроизводимыми биологическими свойствами, глюкозаминогликаны используют в виде три- или тетрабутиламмониевых солей, в качестве ацилирующих агентов применяют ангидриды карбоновых кислот и обработку осуществляют при комнатной температуре.

2. Способ по п.1. о тл ич а ю щи Я с я тем, что в качестве акцептора кислоты используют одно или несколько соединений выбранных -из группы, включающей пириДин, диметиламинопиридин, тризтиламин и трибутиламин, 5

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после ацилирования продукты осаждают с помощью раствора ацетата натрия в зтаноле, осадок растворяют в воде, 10 полученный раствор диализируют против воды.

4. Способ по п,Э, отличающийся тем, что диализ осуществляют в присутствии слабого основания, 15

1831487

Таблица 3

IC 1940: О-бутилированный гепарин, полученный как описано.в примере 5.

IC 1941; О-гексаноилированный гепарин, полученный как описано в примере 6.

lC 1943: О-деканоилированный гепарин, полученный как описано в примере 8.

Таблица 4

Таблица 5

Доза, мкг/мл

smx*

IPT*. Продукт.

Ь

r: время реакции; Ъ": время коагуляции, соответствующее амплитуде отпечатка 20 мм.

amx: максимальная амплитуда. !РТ: показатель тромбодинамического потенциала.

Контроль !

С 1940

IC 1940

Контроль

IC 1941

lC 1941

Контроль

IC 1940

I C 1940 l3,00Ю,81

33,50+2,88

78,75+ 17.34

10,50 Ю,70

14,00М,ОО

20,33Ы,51

13,33М,30

1.2 66й2,08

12,66."й2,08

8,25й1,25

22;25+4,03

40,008,68

4,502,12

10,33+6,50

15,00 4,58

9,00 2.,64

8,002.64

9,83М,01

21,25й1,50

55,75+5,85

122,75Ю3,02

15,002,82

24,33й6,00

35,33+5,03

22,33 +4,93

20 66+4,72

27,50 +5,07.

48,00 +2,44

35,50М,69

27,00й16

57,00 8,48

51 66+10,96

40,33 М,51

47,00 4,58

47,00:й5,29

45,66+5,77

11,25+2,35

2,57М,77

0.82+0,27

37 Оой28 28

21,33 19,85

4,65 М,03

10,334.04

12.00л"5,29

9,33 4,04

1831487

Таблица 6

Испытуемый продукт IC 1940

Таблица 7

Испытуемый продукт 1С 1941

Таблица 8

Испытуемый продукт IC 1943 f831487

130.0 1ИЮ . 1И0 Я00 fdic 80.0 60.0 400 200 0.0

@uzf

ИО.0 ЮИ Я00 ЯЮ 200 ЮЮ . 60.0 460 200 00

Юиг./

f Ы 1 ЮО И0.0 1ЛЫ 1ИЮ ЮУ.Ю Б0.0 400 20.(} . 0.0

Щг.У

1831487

ПТ3)ТП ПТ(7)ТР % )Т1Ю

1ВОО 1Б00 1400 6.ОО 1000 ВОО 600 ЮО ZO0 ОС

ФигФ

1/Од 1Б00 й00 1РО0 ruO0 600 600 400 200 00

ЮигХ Юд %79 ЯОО f_#_0 аОО Ю0 600 4и0 М0 00

Ж гб

1831487

?7 Уб H6

Редактор

Заказ 2540 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

1Я

Ю

Я1

1Х

Я1

Я

Ю

О

Я

4Ю

Я

Я

1Я

1Я

Ю

1Я

Щ

Ю

1Я

Я

Ю

7Р

Я

Ю

Составитель О. Рогачевская

Техред М,Моргентал . " Корректор И. Шулла