Способ получения иммуномодулирующих пептидов
Способ получения пептидов иммуномодулирующего действия включает экстракцию биологически активного вещества из костного мозга млекопитающих, отделение балластных веществ, влияющих на иммунную систему, вызывая выработку антител к высоко молекулярным фракциям полипептида . Способ позволяет получать биологически активное вещество с низкой молекулярной массой, что снимает межвидовую чужеродность, дает возможность применять его в лечении человека. Фракционирование комплекса белков, полученных из костного мозга млекопитающих, привело к повышению его активности за счет изолирования фракции 1 и фракции 2. Иммуномодулирующее его действие направлено на В- и Т- системы иммунитета, повышая количество иммунокомпетентных клеток, статистически значимо при их дефиците, т.е. при вторичных иммунодефицитах. Одновременно происходит активизация резерва клеток иммунной системы, создавая базу для размножения иммунокомпетентных клеток. Способ позволяет уменьшить обьем реагентов , что делает его технологичным и обеспечивает экологически чистое производство, одномоментно повышает выход конечного продукта. 2 ил., 4 табл. СП С
,СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 35/28
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 4, б
1*. П 2
° К ABTOPCKQMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
{21) 4877893/14 (22) 26.10.90 (46) 30,08.93, Бюль 32 (71) Владивостокский государственный медицинский институт (72) Н.С.Мотавкина, В,Б.Туркутюков и
Т,К,Каленник (56) Авторское свидетельство СССР
N 1077089, кл. А 61 К 35/28, 1979. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ПЕПТИДОВ (57) Способ получения пептидов иммуномодулирующего действия включает экстракцию биологически активного вещества из костного мозга млекопитающих, отделение балластных веществ, влияющих на иммунную систему, вызывая выработку антител к высоко молекулярным фракциям полипептида. Способ позволяет получать биологически активное вещество с низкой
Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов, стимулирующих иммунную систему организма.
Целью изобретения является получение . целевого продукта с высокой модулирующей активностью.
Способ осуществляется следующим образом.
Свежий костный субстрат морского животного очищают, измельчают обычным способом, делят на три порции и каждую заливают 3 Д трихлоруксусной кислотой.
Смесь перемешивают в зкстракционной колбе на холоде при -40С в течение суток. экстракцию проводят трижды и объединяют вытяжки всех порций, проводят диализ.про,, Ж„„ 183б954 Al молекулярной массой, что снимает межвидовую чужеродность, дает возможность применять его в лечении человека. Фракционирование комплекса белков, полученных из костного мозга млекопитающих, привело к повышению его активности за счет изолирования фракции 1 и фракции 2. Иммуномодулирующее его действие направлено на Ви Т- системы иммунитета. повышая количество иммунокомпетентных клеток, статистически значимо при их дефиците, т.е, при вторичных иммунодефицитах. Одновременно происходит активизация резерва клеток иммунной системы, создавая базу для размножения иммунокомпетентных клеток.
Способ позволяет уменьшить обьем реагентов; что делает его технологичным и обеспечивает экологически чистое производство, одномоментно повышает выход конечного продукта. 2 ил., 4 табл. тив дистиллированной воды. Высаливание осуществляют предварительно подсушенным сульфатом аммония (5 r соли Hà I л вытяжки). Надосадочную жидкость декантируют и к полученному прозрачному раствору приливают. ацетон (чда), предварительно охлажденный до -5 С. Осаждение протеинового комплекса ведется в течение
24 часов в холодной камере. Полученный осадок фильтруют через бумажный фильтр и высушиваЮт на воздухе. Протеиновый комплекс извлекают многократной экстракцией бидистиллятом, предварительно нагретым до +37 С при постоянном перемешивании. В результате получают слегка опалесцирующую бледно-желтую жидкость, которую лиофилизуют. Высушенный препарат представляет собой легкий
1836954 порошок кремового цвета. Дальнейшее обессоливание и концентрирование ведут на ультрафильтрационной мембране
AmIc0n PM-10. Фильтрат лиофилизуют, порошок растворяют в малом объеме ацетатаммонийного буфера с рН = 6 (0,556 г в 2 мл буфера), немного подкисляя 0,1 Н раствором СНзСООН до полного растворения, Гетерогенность комплексного пептида доказывают, подвергая его гельхроматографии, Для этого элюировэние фракций ведут на колонке с сефадексом G-50, предварительно уравновешенном в буфере. Контроль фракционировэния осуществляют обычным способом при помощи автоматического коллектора и аппарата "Юсотб". Профиль гельфильтрации устанавливали измеряя оптическую активность фракций на СФ-26
° "ЛОМО". Профиль элюции имел три пика, вид которых изображен на фиг.1, Фракции выделены препаративно. С помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле с кумэсси голубым в присутствии додецилсульфата установлено, что малярная масса фракций соответственно равна 10 КД, 8 КД, 5-6 КД, Точечная молярная масса активной фракции была определена на колонке с Р-60 в присутствии декастрана голубого при элюции сукцинатным буфером обычным спосо-. бом. Молярная масса равна 5100-5300 Д.
Наиболее оптимальные условия получения протеинового комплекса были подобраны экспериментально.
В частности, режим высаливания предполагает применение насыщенных растворов, С этой целью была подобрана концентрация высаливающего раствора, которая составила 5 г/л сульфата аммония, Для достижения полноты экстракции протеиновых комплексов были проведены эксперименты при разных температурах, Результаты показаны на фиг,2, Как -следует из результатов исследования, наибольшая полнота экстракции комплекса достигается при 37 С„поэтому это значение было отобрано в качестве окончательного.
Для установления пептидной природы комплекса был проведен аминокислотный анализ.
Химический анализ суммарного полипептида представлен в табл, 1, аминокислотный спектр — в табл.2.
Аминокислотный спектр активной фракции пентапептидной природы охарактеризован глутаминовой (4,45 ), аспарагиновой (3.59 7}, лизином (2,82 ), пролином (1,43 /), аргинином (1,49), тяжелых металлов и алюминия в активной фракции не обнаружено.
Пептиды были лиофилизированы при -10 С, По сравнению с аналогами предлагаемое техническое решение обладает новиэ5 ной и рядом преимуществ (табл,3).
Более подробные сведения об иммуномодуляторах преДставлены в табл,4, Комплексный полипептид, как видно, оказывал существенное влияние как на Ттак и В-лимфоциты. Однако, если в целом количество Т-лимфоцитов увеличивалось незначительно (нэ 4,8 ), то на выход Т-лимфоцитов разной степени зрелости это действие было более выраженным. Уровень аута-РОК возрастал в 2.5 раза, стабильных
Е-РОК вЂ” почти в 2 раза. Количество активности Е-POK клеток регуляторного ряда (TPРОК, ТЧ-РОК) изменялось в меньшей степени — соответственно нэ 2,617,, 7,367(», 3,047, . Синхронно с этим изменялся индекс — ТР/ТЧ вЂ” с 0,99 до 1,19.
Более выраженным оказалось воздействие на общее количество .В-лимфоцитов.
Их количество возрастало на,9,21$, то есть почти вдвое, но численность зрелых M-P0K имела тенденцию к уменьшению.
Таким образом, комплексный полипептид обнаружил более высокую иммуномод- улирующую активность в отношении общего количества В-лимфоцитов, стабильных и аутосубпопуляций Т-лимфоцитов. несколько меньшую — в отношении ТР-РОК с хелперной функцией (рост в 2,5 раза), общего количества Т-лимфоцитов (в 1,5 раза), активных Е-Р0К (в 1,5 раза), стабильных
Е-РОК (в 2,2 раза), А-РОК (в 4 раза), общего количества В-лимфоцитов в 3,1 раза, при нейтральном отношении к Тч-Р0К С супрессорной функцией, благодаря чему соотношение Тр/Тч приближалось к норме.
Та же направленность изменений в уровне Т- и В- лимфоцитов, их субпопуляций, но менее выраженная отмечена у фракции 1i
Фракция-И! практически иммунномодулирующий эффект не обеспечивала.
Таким образом, иммуномодулирующее действие на Т- и В- лимфоциты с учетом степени их зрелости и активности регуляторного звена Т-лимфоцитов наиболее выражено (убывающей степени) в фракции-1, фракции-2, комплексного полипептида, Они найдут широкое применение в практическом здравоохранении для лече55 ния больных иммунодефицитами различной глубины и направленности.
Формула изобретения
Способ получения иммуномодулирующих пептидов, включающий измельчение костного мозга, экстракцию уксусной кисло1836954 6 той, отделение примесей последующим осаждением целевого продукта, его очисткой и лиофилизацией, о т л и ч.а ю шийся: тем, что, с целью повышения выхо- . да и специфической активности 5 продукта, в качестве сырья используют костный мозг морских млекоТаблица1
Результаты исследований общего химического состава полипептидов.
Моносахариды, Общий белок, Белок,g
Проба
Нуклеиновые кислоты
Полипепти ы
2.35
32,12
25,63
1,22
Табл и ца 2
Результаты исследования аминокислотного Состава полипептидов.
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого способа получения пептидов и иммуномодуляторов с аналогами
» ° « »»»»»»»»юМ»»
Предлагаемый способ
Аналог 2
Аналог 1
Признаки
° »»»»»»»» »»»»
Наземное сырье Убойный скот
Иорское сырье
Высокая
Низкая и крайне Низкая низкая
Уксусная к-та Уксусная к-та
34 р-р трихлорук-. сусная к-та
Технологичность Высшая с малым объемом экстрагента, Низкая
Низкая
Источник
Экономическ. выгода
Экстрагент питающих, экстракцию проводят трехпроцентным раствором трихлоруксусной кислоты. а после осаждения сульфатом аммония целевой продукт экстрагируют бидистиллированной водой, нагретой до 37 С. а очистку проводят ультрафильтрацйей и гел ьхроматографией.
1836954
Продолжение табл 3.
Хлористый цинк Хлористый цинк
Добавляемые .агенты
Сульфат аммония
Высокая
Высокая
Отсутствует
ТОКСИЧНОСТЬ
ЗКОЛО ИЧНОСТ b
Высокая за счет малой токсичности
Бидистиллят при
+37 С., Обессоливанае при рН=4,$
Низкая за счет Высокая высокой токсичн, Ие указано
Не указано
Обеспечение полноты извле1 чения
Удаление малоактивных Фракций
Не проводится Не проводится
Гельфильтрация
5100-5300 Д
Отсутствует
Не указано
Не приводится
Не указано
Молекул. массы Аллергичность
Высокая и умеренная
Антигенность
Не указано
На В"звено Высокая, умеренная
Низкая
Отсутствует
Иммуномодулирую- Высокая на В- и щая активность Т-звено иммунитета
Таблицв 4
ИММУНОМОДЛПРУЩйЯ АКБ(ННЗСТЬ КИПБИ(опОЕО ПЩПЫНИПА Y. ЕГО 4РАЕЕ2 НА i "КТО ИЯ
ИХНЮЮ СКОТЕ."Ю (3-ОИ Г НПЬИХ С 8ТОИййзИ ИаЧОДййдтай
АОЫ ЬЧ8КС белков
Е-FOR % (T)
Е-акт. РОК %
Е ст. РОК %
A+FOR %
Тр-РОК % (Т)
Те-РОК % (Т), Tp/Úi
ElC-РОК % (B)
М-РОК %
22,50 +- Е,04
Е7,50 +- I,OI
13,45 + ?,22
7,00 — 045
E8,00 + 0,36
I8 I4 +- I,09
0,99
IO,I5 + 2,30
29,00 + I,49.27,3Š— 0,39
20,П + I,35. 25,09 + 2,34
I7,9 — I,O3
25537 — 0 49
2I,I8 I,28
I,Е9 е
- -Х9,36+ 3,IQ
24,36+ 4,I5
34,50 +- 2,I4
26,50 + I,ÎI
ЗЕвСО +- 2з25
43,50 — I,47
Е9,49 +. 2@8
I,77
23,00 + Е,34
ЗЕ,CO +- 0,94
24,IO +- 0,35 .. 25,00.+- 0,90
3I,50 — I,I5
Е9,0I +- 0,73
I,65
32,ЗЗ + I,ÇI
27,50 + I,07
2Е,4З + Е,35
Е7,00 - О,86
Е4,09 + 0,39
8,36 - 0,4I
I3,3I + О,З9
Е8,О5 + О,89
I,0I
IO,I4 - 2,36
-28,43 + I;47
1836954
f,0
Ъ Р
% рр
Р„г
3 å 4Ф ХЮ
Жжероюуря;
Составитель Т.Каленник
Техред М.Моргентал
Редактор С. Кулакова
Корректор О. Кравцова
Заказ 2849 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
