Способ получения амидов

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способов получения амидов биотехнологическим окислением нитрилов. Алифатические, ароматические или гетероциклические нитрилы помещают в среду, в которой культивируют штаммы-продуценты нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous 1-1 (PERM BP-1478) или АТСС 33278, или АТСС 33025. Процесс ведут при 1.0- 30°С и рН 7,0-9,0 в присутствии солей Со. взятых в количестве 5-15 мг/л в пересчете на . 3 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПАТЕНТУ

1 (21) 4356476/13 (22) 16,09.88 (46) 30.08.93. Бюл, ¹ 32 (31) 234597/87; 72766/88 (32) 18.09.87; 26.03.88 (33) JP

С (71) Хидеаки Ямада и Нитто Кагаку Когио Кабусики Кайся (JP) (72) Хидеаки Ямада и Тору Нагасава (JP) (56) Патент ЕПВ ¹ 204555, кл. С 12 P 13/02, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУ4ЕНИЯ АМИДОВ

Изобретение относится к способу гидратации нитрилов с их превращением в соответствующие амиды действием нитрилгидратазы, производимой микроор.ганизмом. Более конкретно,.настоящее изобретение относится к способу получения амидов биологическим путем, характеризующемуся используемым микроорганизмом и способом образования нитрилгидратазы.

Изобретение создано на основе того открытия, что особый штамм рода

Rhodococcus, а именно, штамм 1-1 вида

rhodochrous не образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион железа, но образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион кобальта, и образующая нитрилгидратаза может использовать в качестве субстрата ароматический нитрил с его превращением в амид.

Соответственно способ получения амидов настоящего изобретения является способом получения амидов биологическим путем, в котором нитрил гидратируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом, и

„,5U „„1838416 А3 (я) С 12 Р 13/02, С 07 С 231/06 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способов получения амидов биотехнологическим окислением нитрилов.

Алифатические, ароматические или гетероциклические нитрилы помещают в среду, в которой культивируют штаммы-продуценты нитрилгидратаэы Rhodococcus rhodochrous -1 (FERM BP-1478) или АТСС 33278, или

ATCC 33025. Процесс ведут при 10-30 С и рН 7,0 — 9,0 в присутствии солей Со, взятых в количестве 5 — 15 мг/л в пересчете на CoClz, 3 з.п. ф-лы. способ характеризуется тем, что укаэанную нитрилгидратаэу получают культивированием микроорганизма вида Phodococcus

rhodochrous в присутствии ионов кобальта.

Согласно настоящему изобретению несмотря на нулевую активность нитрилгидратазы в культурной среде, содержащей ион . железа, в культуральной среде. содержащей ион кобальта, активность будет расти. Можно считать совершенно неожиданным, то, что деятельность нитрилгидратазы указанного специфичного микроорганизма будет решающим образом зависеть от типа присутствующего в культурной среде иона металла.

Более того, в соответствии с настоящим . изобретением можно успешно проводить гидратацию ароматического нитрила. Положительный эффект настоящего изобретения определяется важностью никотинамида— продукта гидратации З-цианопиридина, в качестве исходного продукта в синтезе витамина или пираэинамида — продукта гидратации цианопиразина, используемого в качестве туберкулостата.

1838416

1. Некоторые общие положения способа получения амида биологическим путем

Изобретение относится к способу гидратации нитрила с превращением его в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образуемой микроорганизмом, и в основе способа лежит культивирование микроорганизма, индуцирование нитрилгидратазы и действие полученной в результате нитрилгидратазы на нитрил в качестве субстрата.

Укаэанные стадии сами по себе известны в виде отдельных операций, и они в соответствующей форме используются в настоящем изобретении. Выражение "нитрилгидратазу получают культивированием микроорганизма в присутствии иона кобальта" имеет в виду индуцирование нитрилгидратазы как естественную предпосылку, Преамбула настоящего изобретения, звучащая как; "способ гидратации нитрила с его превращением в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом". включает любые оформления или вариации, приводящие к действию нитрилгидратазы на нитрил. В качестве одного иэ примеров такого оформления можно указать способ выделения образованного микроорганизмом фермента и поеледующее его использование в виде ферментивного препарата. Такой путь использования нитрилгидратазы при котором фермент используют в виде ферментивного препарата, следует понимать, как попадающий в категорию "способа получения биологическим путем" настоящего изобретения.

2. Подробности реакции гидратации

1) Микроорганизм

Применяемый в настоящем изобретении микроорганизм относится к виду

Rhodococcus rhodochrous.

Представительным штаммом этого вида является штамм 1-1.

Характеристика штамма И: (1) Происхождение и депоэитирование

Штамм 1-1 выделен из почвы, отобранной в Сакио-ку, Киото, Япония, и депоэитирован как международный депозит (в соответствии с Будапештским Соглашением о международном признании депозитов микроорганизмов для целей патентной практики) в исследовательском Институте ферментации, Япония„Агентство по промышленным разработкам и технологии под регистрационным. номером FERM BP-1478. (2) Бактериологические свойства (а) Морфология (1) Форма и размер клегок — 0,9-1,0р х

3-10p. (2) Наличие полиморфиэма в клетках — Клетки имеют форму

5 длинных стержней на начальных этапах культивирования, рост с изменением формы и затем деление на ко10 роткие бациллы. (3) Подвижность — Отсутствие. (4) Присутствие спор — Отсутствие. (5) Окраска по Граму — Положительная, (6) КислотоустойчиОтрицательная.

{7) Гетерофильные гранулоциты — Обнаруживаются. (о) Состояния роста в различных культурных средах (30 С) (1) Бульоная культура на пластине агара — Окружность диаметром 1 мм (48 часов), неравномерная и гладкая, поверхность довольно сухая, плос25 кая, непрозрачная, бледно-оранжевая-розовая окраска.

{2) Бульоная культура на скошенном агаре — Нити с довольно су30 хой гладкой поверхностью, в сечении слегка проступающая довольно сухая, бледно-оранжевая-розовая

35 окраска. (3) Бульоная жидкая культура— Цветущий рост, обраd зование бактериальной клеточной мембраны, умеренное помутнение, образование осадка по мере роста. (4) Бульоная культура на столбике желатина — Рост мелкими час45 тицами на поверхности, в форме конуса в части столбика, но не в его нижней части, разжижение желатина

50 не наблюдается. (5) Лакмусовое молоко— Беэ изменений. (с) Физиологические свойства

55 (") Восстановление нитратов— Положительно. (2) Денитрификация — Отрицательно. (3) MR-тест — . Отрицательно. (4) YP-тест— Отрицательно. (5) Образование ин1838416

Кислота

Газ

L — арабиноза

0 — ксилоза

0 — манноза

0 — глюкоза +

0 — фруктоза +

Мальтоэа

Сахар

Лактоза

Трегалоза

0 — Сорбит +

0 — Маннит +

Глицерин

+; положительно; †: отрицательно. (24) Выращивание в единичном источнике углерода:

Иноэит

Мальтоза +

0-Ман нит +

Рэмноэа

0-Сорбит

M-Гидроксибенэойная кислота

Адипат натрия

Бенэоат натрия

+ долэ— Положител ьIIQ. (6) Образование сероводорода — Положительно. (7) Гидролиз крахмала— Отрицательно. (8) Усвоение лимонной кислоты:

Культурная среда Кокура— Отрицательно, Среда Кристансена — Положительно. (9) Усвоение неорганического источника азота: нитрат— Положител ьно. аммониевэя соль — Положительно, (10) Образование красителя— Отрицательно. (11) Уреаза— Положительно. (12) О ксидаза — Отрицательно. (13) Каталаза — Положительно. (14) Гидролиз целлюлозыв Отрицательно. (15) Условия роста— рН 5-10. Температура 10 — 41 С. (16).Отношение к кислороду— Азробны. (17) Разложение тирозина— Положительно. (18) Разложение аденина— Положительно, (19) Фосфотаэа — Положительно. (20) Гидролиэ

Твин 80 — . Положительно. (21) О-F-тест — Отрицательно (22) Те ил осто и ко ст ь (в 1,0 снятом молоке, 72 С, 15 минут) — Отсутствие, (23) Образование кислоты и газа из сахаров:

Цитрат натрия

Лактат натрия

Тестотетрон

1 -тироэин

5 Глицерин (1 мас.$/oá.) ()

Трегалоза (+) и-Гндроксибензойна я кислота (1 мас. $/об,)

+: положительно; -: отрицательно; (+)

10 слабо положительно. (25) Жирные кислоты и анализ клеточных стенок— Присутствие ненасыщенных и насыщенных жирных кислот нормального строения и туберкулостеариновой кислоты, ТТГ! миколевой кислоты

20 дает одно пя.:.

B результате классификации вышеприведенных бактериологических свойств в свете Вergy s manuac of Systematic

Bacteriology), выясняется, что штэмл1 I-1 является азробной, грэм-псгложитольнп слабо кислотоустойчивой, каталээ-поло.к 1 тельной и негенерирующей зндоспор с.циллой, которая не внедряет жгутиков, I la начальных стадиях роста имеет форму удлиненной палочки подобно мицелию, рэс— ветвлением и затем делится на короткие палочки, Таким образом, признак t ее принадлежность к бактериям типа Nocardia.

Анализ состава жирных кислот показывает, что бактерия содержит насыщенные и ненасыщенные нормальные кислоты, в том числе туберкулостеариновую кислоту, ТСХанализ миколевой кислоты дает одно пятно с тем же значением Rf, что и для стандартной бактерии Rhodococcus hodochrous (! F03338), что отличает ее от рода

Mycobacterium. Она также отличается от рода Nocardla составом (числом атомов углерода) миколевой кислоты. Из рассмотрения

45 других биохимических свойств следует, что бактерия является Phodococcus

rhodochrous.

Кроме штамма И. открытого создателями изобретения, и который по их мнению является наиболее предпочтительным для вида R.rhodochrous, нижеперечисленные штаммы являются примерами других штам. мов В rhodochrous, которые могут быть использованы в настоящем изобретении и которые можно получить в указанных хранилищах: (l) IFO 3338, (! I) IÑÌ 2157, (Ill) I CM 3302, (! \/) NCi B 9703, 1838416 (Ч) NCIB 11277

Указанные штаммы депозитированы в огедующих хранилищах

IFO — Институт ферментации, Осака, Япония, luso Honmachi 2 chome, Osaka — shi, 532, Япония;

ISM — Коллекция микроорганизмов Японии, Рикен (Институт физико-химических исследований). Wako-shi, Saitama, 351-01, Япония;

NCIB — Национальная коллекция промышленных и морских бактерий, Абердин, Шотландия, Великобритания.

Микроорганизмы имеют тенденцию к мутациям. В связи с этим нет необходимости подчеркивать, что бактерия, даже являясь мутантом исходной бактерии, такой как штамм I-1, может быть использована в способе настоящего изобретения, если только продукты культивирования мутанта образуют в присутствии ионов кобальта нитрилгидратазу, 2) Субстрат (нитрил)

Нитрилы, используемые в качестве субстрата нитрилгидратаэы, образованной вышеописанным микроорганизмом, относятся к ароматическим и алифатическим мононитрилам или динитрилом, особенно мононитрилам.

Нитрилы, для которых наилучшим образом используются особенности настоящего изобретения, являются ароматическими нитрилами, в частности, нитрилы с 4-10 атомами углерода, образующими ароматический цикл. Несколько типичных примеров ароматических нитрилов представлены соединениями нижеследующих формул (!)-(VI)

Типичными для них являются 5-, 3- и

2-цианопиридин ы; 1 2. где R u R соответственно представляют Н, 1 2

СНз, ОН, ОСНз, CI, F, CN, КН2 или й02.

К их числу относятся бензнитрил. о-, ми и-хлор или о-, м- и и-фтор- бензнитрилы, ои м-нитробензнитрилы, и-аминобензнитрил, о-, м- и п-толунитрилы, 4-цианофенол, анизонитрил, фталонитрил, иэофталонитрил, терефталонитрил, 2,6-дихлорбензнитрил и 2,4-дихлорбензнитрил, 2,6-дифторбензонитрил, ОоО-си

Формуле (!!!) соответствуют а — j3-наф тонитрилы.

Х -си (I V) где Х представляет S или О.

Типичным представителем соединений формулы (IV) является 2-тиофенкарбонитрил и 2-фуронитрил.

10 NH (V) о3-с (И) Типичным примером И является цианопиразин.

Другая группа нитрилов, составляющих объект настоящего изобретения, включает и редпочтител ьно алифатические нитрил ы, более предпочтительно моно- или динитрилы с 2-6 атомами углерода, но наиболее предпочтительно-мононитрилы, С точки зрения полезности получаемых амидов типичным примером является акрилонитрил, образующийся с хорошими выходами, Ясно, без особого обсуждения, что амидами, соответствующими указанным нитрилам, являются амиды, полученные превращением CN-группы нитрилов в

CONH2-группу, В случае динитрилов следует рассматривать вариант получения соответствующих амидов превращением по меньшей мере одной CN-группы в CONHzrpyn пу.

3) Кул ьтиви рован ие-п родуци рова ние

40 нитрилгидратазы.

Культивирование микроорганизма вид

Rhodococcus rhodochrous может быть осуществлено в любых приемлемых условиях, но в присутствии в культурной среде ионов кобальта. Может оказаться общим правилом введением в культурную среду индуктора фермента, подробно описанного ниже, с целью вызвать накопление нитрилгидратазы в бактериальных клетках. (!) Баэальная среда, Примеры приемлемых культурных сред иллюстрируются следующим образом. Для специалиста не составит труда изменение количеств-(а) компонента-{ов), приведенных ниже, замена одного компонента другим и исключение некоторых компонентов-(а) или добавление других компонентов-(з). (1) Культурная среда А

Компонент

Кол и чество (в 1 л среды) Типичным примером (V) является 5-цианоиндол.

15 М

1838416

Остальное (р Н 7) 10

25

Витаминная смесь *1 0,1 мл

КрНРО4 13,4 г

КН2РО4 6,5 г

Na CI l г

MgS0q 7Н20 0,2 г 5

Дистиллированная вода

* 1 Состав

Еиотин 2 мкг

Пантотенат кальция 0,4 мг

Инозит 2мг

Никотиновая кислота 0,4 мг

Хлоргидрат тиамина 0,4 мг

Хлоргидрат пиридоксина 0,4 мг 15 и-Аминобензойная кислота 0,2 мг

Рибофлавин 0,2 мг

Фолиевая кислота 0,01 нг

Вода до 1л (l1) Культурная среда Б

1глицерин 10г

Пептон 5г

Экстракт солода Зг

Дрожжевой экстракт 3 г

Дистиллирован ная вода Остальное (рН 7,2) (111) Культурная среда С

Дрожжевой экстракт 3 г

КН2РО4 0,5 r 30

К2 Н РО4 0,5 г

Mg SO4 7H2O 0,5 г

Дистиллированная вода Остальное (рН 7,2) (2) Индуктор фермента 35

Индукторами фермента, предназначенными для индуцирования и продукцирования нитрилгидратазы в микроорганизме

Rhodococcus rhodochrous могут служить любые пригодные для этой цели вещества. 40

Типичными индукторами, пригодными для настоящего изобретения являются нитрилы и амиды.

Примеры индукторов фермента, чье действие подтверждено для штамма 1-1, 45 включают следующие соединения: кротонамид, ацетонитрил, пропионитрил, бензамид, пропионамид, ацетамид, изовалеронитрил. н-бутиронитрил, изобутиронитрил, н-капронитрил, 3-пентеннитрил, 50 пивалонитрил, н-бутирамид, изобутирамид, н-валерамид, н-кап ронамид, метакриамид и фенилацетамид. (3) Источник ионов кобальта

Нитрилгидратаза не образуется даже в 55 случае присутствия в культурной среде индуктора фермента, поэтому в соответствии с настоящим изобретением существенным моментом является присутствие в ультурной среде ионов кобальта.

Поскольку культурной средой является водная среда, наличие ионов кобальта, как правило. создают добавлением в культурную среду водорастворимого соединения кобальта, Водорастворимые соединения кобальта приводятся в химических CRравочниках. так что специалист без затруднений выберет и будет использовать приемлемое соединение (в некоторых случалх с помощью простых предварительных опытов), Типичными соединениями кобальта являются соединения, дающие ионы Со и Со, в особенности, соединения, образующие ионы Со, и конкретные примеры соединений кобальта включают: хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта, бромид кобальта. борат кобальта и т.п. * (4) Культивирование

Куль ивирование с целью прод, „н .: ния и, tàêoïëåíèë нитрилгидратазы в бактериальнь.х клетках может быть осуществлено культивированием используемого микроорганизма, например, штамма 1-1 в культурных средах, описанных выше, в прием е ix условиях.

* Вигамин В12 и металлический кебал г являются другими примерами кобалыовых соединений, т.к. они образуют is situ ион кобальта в культуральной среде чер.: .- .:. зационное и окислигельное действие микроорганизма в течение культивирования.

Количество используемого индуктора фермента составляет 2 —.6 г на литр культурной среды, количество. ионов кобальта составляет 5 — 15 r на литр культурной среды в пересчете на CoClz, Конкретные примеры состава культурных сред приводятся ниже, (1) Культурная среда А l литр

Ацетонитрил (индуктор) 2г

CoClz 10 мг (II) культурнал среда В 1 литр

Изовалеронитрил 2г

Co C l z 10 мг (ill) Культурная среда С 1 литр

Кротонамид 2г

Со С12 10 мг

Нитрилгидратаза может быть с успехом продуцирована культивированием при встрлхивании штамма 1-1 в температурном интервале 15 — 50 С, предпочтительно 20—

45 С, наиболее предпочтительно около

30 С при рН 7 — 9 в течение примерно 30 часов или более, предпочтительно 40 часов или более (при верхнем пределе около 120 часов). Индуктор фермента предпочтительно присутствует на начальном этапе культивирования и для получения бактериальных клеток с высокой активностью желательно добавление индуктора. Например. если

1838416

15

45

55 встряхивание культуры проводят при 28 С в течение 76 часов добавляют дополнительные количества кротонитрила спустя 26 и 56 часов после начала реакции с тем, чтобы его концентрация в каждый момент составляла

0,27; (мас,/об.).

4) Гидратация нитрила— Преамбула йастоящего изобретения, звучащая как "способ получения амидов биалогическим путем, в котором нитрил гидратируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом", включает, как указано выше, различные приемлемые оформления и вариации пути действия нитрилгидратазы на нитрил, Один из вариантов заключается в продуцировании амида в культурной среде микроорган изма, в которой в качестве субстрата присутствует нитрил.

Другой вариант вызвать действие нитрил гидратазы на субстрат заключается в добавлении субстрата (нитрила) в культурную среду, в которой накоплена нитрилгидратаза. с проведением реакции гидратации. Видоизменением приведенного варианта является использование культурной среды, в которой клетки микроорганизма были разрушены с образованием "культурной среды, в которой накоплена нитрилгидратаза".

Еще один вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на ее субстрат заключается в выделении клеток, в которых накоплена нитрилгидратаза, иэ культурной среды, предпочтительно путем нанесения клеток на приемлемый носитель или путем их "иммобилизации" с последующим их контактированием с субстратом, Этот способ, в частности, рекомендуемый вариант„в котором применяют иммобилизованные клетки, как полагают, приемлем для промышленного использования и в этом отношении более предпочтителен по сравнению со вторыми вышеприведенными вариантами. Методика с применением иммобилизованных клеток хорошо известна, то же самое относится и к типу носителя, в целом же — это способ иммобилизации клеток на носителе и использование иммобилиэован ного микроорганизма в так называемом биореакторе.

Другой вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на субстрат заключается в получении ферментивного препарата нитрилгидратазы и гидратировании нитрила с помощью ферментивного препарата, но не биологическим путем. Очевидно, что проведение реакции гидратации этим путем должно быть осуществлено при таких значениях рН и в таком температурном интервале, при которых активность фермента не теряется. Можно сказать, что эти условия будут теми же, что и в случае гидратации

"биологическим путем", приведенном выше. Как показано выше, вариант, в котором микроорганизм отсутствует в ходе дейстгия фермента, в настоящем изобретении также рассматривается как "способ получения биологическим путем.

Согласно настоящему изобретению приемлемый интервал значений рН для нитрилгидратаэы составляет 7 — 9 при оптимальном значении рН 8. При значении рН в растворе ниже 7 активность фермента имеет тенденцию к резкому уменьшению. Соответственно, желательно добавление в реакционный раствор буфера, Даже при использовании одного из таких буферов как калийфосфатный буфер, буфер трис-HCI, буфер НЕРЕЯ-КОН и натрийборатный буфер ферметивная активность нитрилгидратаэы не меняется, Концентрация субстрата в культурной среде или в растврре, реакции гидратации, как правило, составляет интервал 4 — 7 молей на литр, температурный интервал реакции обычно 10 — 30 С.

3. Экспериментальные образцы.

Способ измерения ак(ивности нитрилгидратазы и определение единицы активности в экспериментальных образцах приводятся ниже, (I) Способ определения активности нитрил гидратаэы.

Активность нитрилгидратаэы измеряют проведением реакции с 2 мл реакционной смеси, содер>кащей 10 мМ бензнитрила, 30 мМ калийфосфатного буфера (рН 7) и определенное количество клеток микроорганизма (выделенных из культурной среды) 5 минут при 10 С и добавлением 2 мл 1 í. HCI для прекращения реакции, (2) Определение для единицы активности

Одну единицу(Е) активности нитрилгидратаэы определяют как количество фермента, необходимое для образования бенэамида иэ бензнитрила в вышеприведенных условиях со скоростью 1 мкмоль/мин.

Ссылочный пример 1.

Штамм I-1 культивируют в культурной среде, состав которой приведен ни>ке, в условиях, которые. также приводятся ниже, и проявления активности нитрилгидратазы выявляютдобавлением CoClz и/или ЕеЯО к культурной среде в ходе культивирования. (1) Состав культурной среды

Компонент Количество (в литре среды) 1838416

3 мл

0,5 г

0,5 г

0,5 r

2 мл

Витаминная смесь

К IPQ<

КН РОа

MgSGe 7Н2О

ПрОпионитрил

Дистиллированная вода Остальное (рН 7,2) (ll) Условия культивирования

28ОС, 70-80 часов

Полученные результаты приводятся в

TA Oil. 1 .

Можно видеть, что активность нитрилгидратазы не проявляется даже при добавлении FeSO< к базовой среде, но проявпяется при добавлении СоС!2, причем добавление FeS04 в систему, в которую уже добавляя CoCI2, неблагоприятным образом влияет на результаты, Ссылочный пример 2.

Действие различных нитрилов или амидов в качестDG индукторов штамма !-1 показано в нижеприведенной Таблице.

Приведенные в табл. 2 результаты получены предварительным культивированием штамма I-1 в вышеописанной культурной среде В при 28ОС при добавлении нитрила или амида в качестве индуктора в количестве 0,1% (об./об.) или 0,2% (Mac./об.) соответственно после достаточной пролиферации штамма с последующим заражением штаммом вышеприведенной культурной среды С, в которую добавлено

0,001% (мас./об.) СоС!г, и культивированием 36-48 часов.

Пример 1, Клетки штамма I-1, полученные культивированием штамма в культурной среде, состоящей из вышеописанной культурной среды С, в которую добавлены

СОС!2 и кротондмид В количествах соответ ственно 0,01 г и 2 г на литр среды, вводят в реакцию с различными, используемыми в качестве субстратов нитрилами, Реакцию проводят исйользованием 2 мл реакционного раствора, содержащего клетки, полученные из 2 мл культуры, 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 200 MM субстрата (25 С, 76 часов), Реакцию прекращают добавлением 0,2 мл 1 н. НС!. Активность нитрилгидратаэы по отношению к соответствующим субстратам определяют квк отношение израсходованного количества субстрата или продукта реакции, определенное с помощью ЖХВД, к активности нитрилгидратаэы, определенной при использовании в качестве субстрата 3-цианопиридина, и называют удельной активностью (%).

Полученные результаты приводятсл ни>ке.

Субстрат Уд. активность (%) 3-Цианопиридин 100

Акрилонитрил 106

4-Цианопиридин 129

2-Цианопиридин 64

5-Цианоиндол 9

2-Тиофенонитрил 116

2-Фуронитрил 71

Бензонитрил 80

4-Цианофенол 24

10 и-Лминобензнитрил 16 м-Нитробензнитрил 7 о-Нитробензнитрил 16 м-Хлорбенэнитрил 29 и-Толунитрил 5

15 м-Толунитрил 46

Анизонитрил 20 о-Хлорбензонитрил и-Хлорбенэнитрил

2,4-Дихлорбензнитрил 2

20 2,6-Дихлорбензнитрил

Цианопиразин 80

П р» м е р 2. В колбу Сакагучи на 1 литр помещают 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды

25 С, в которуюдобавлены CoCI2 и кротонамид в количестве соответственно 0,01 и 2 r на литр среды, и смесь культивируют при 28 С на трясучке. Культивирование продол>кают с добавлением в культурную среду 0,2%

30 (масс./об,) кротонамида (800 мг/400 мл) через 30 и 60 часов после начала культивирования.

Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1200 g, 35 15 минут) в центрифужном сепараторе (Хитачи, модель SCR 20 В); промывают 0,85% °

NaCl, вновь центрифугируют и суспендируют в 40 Mfl вышеописанного раствора, Отбирают в качестве образца небольшое

40 количество суспензии и используют для. подсчета сухой массы бактериальных клеток в суспенэии.

Содер>кащую клетки суспензию (соответствует 2,33 мг сухих клеток) добавляют к

45 4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и

3-цианопиридина (4,57 M) и реакционную смесь выдерживают в течение ночи при

25 С, добавляя к реакционному раствору

50 0,55 M и 0,49 М 3-цианопиридина серу 3 и 6 часов соответственно, Через 18 часов после реакции инициирования выход никотинамида 5,58 M. Соответственно, конверсия составляет 99,5%, что соответствует накоплению никотинамида а количестве 681 г. При данной концентрации продукт реакции затаердевает а результате отложения никотинамид.

Полученный а результате никотинамид идентифицируют выделением продукта а

1838416 виде кристаллов, проведением элементного анализа, ИК-, ЯМР- и масс-спектрометрии.

Никотиновая кислота не обнаружена.

Пример 3, Содержащую клетки суспенэию (соответствует 2,33 мг сухих клеток, 5 полученных в примере 2) добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и цианопиразин в различной концентрации, В результате 6-ти часовой реакции четыре моля цианопиразина превращены со 100%-ой конверсией в пиразинамид, шесть молей цианопираэина превращены в результате 9ти часовой реакции, С другой стороны, при добавлении суспензии, содержащей 4,66 15 мг сухой MGccbl, а не 2,33 мг, как в описанном выше опыте, к аналогичному реакционному раствору (4 мл)

7 М цианопиразина превраща1от в пиразинамид с конверсией 100% в результате 6-ти 20 часовой реакции, 8 М цианопиразина превращают в результате 9-ти-часовой реакции. Образование пиразинкарбоновой кислоты не обнаружено.

Пиразинамид кристаллизуется из рас- 25 твора по мере образования. Кристаллический осадок отделяют и перекристаллиэовывают из метанола. Принадлежность кристаллов пиразинамиду подтвержде но элементным анализом, И К-. 30

ЛАР- и масс-спектрометрией.

Анализ цианопираэина, пиразинамида и пираэинкарбоновой кислоты проведен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. 35

Аналогичный анализ также проводился в нижеследующих примерах.

Пример 4. Суспенэию бактериальных клеток (соответствует 4,66 Мс сухих KflBroK), полученную в примере 2, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М метакрилонитрила соответственно через 1 и

3 часа после начала реакции. Спустя 12 часов после начала реакции образуется 9 M 45 мотакриламида с конверсией 100%.

В вышеописанной реакции при прибавлении дополнительно 1 М метакрилонитрила через 5 часов после начала реакции

r олучают 10 M метакриламида (конверсия

100%) через 24 часа после начала реакции.

Концентрация в 10 M соответствует 851 г метакриламида, которые образуются и накапливаются в пересчете на 1 литр реакци55 онного раствора.

Реакционный раствор разбавляют водой и бактериальные клетки удаляют центрифугированием (12000 g, 15 минут).

Свободный, or клеток раствор концентриру loT в роторном испарителе ll коисталлизуют.

Затем кристаллы растворяют и перекристаллизовывают иэ воды с получением кристаллического метакриламида.

Пример 5. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (р(-(8) и 1 М кротонитрила, после чего при 25 С проводят оеакции с пятикратным добавлением в реакционный раствор с интервалом в 1 час метакрилонитрила порциями в 1 M. Через б часов после начала реакции получают б М кротонамида (конверсия 100%), При добавлении к реакционному раствору через б и 10 часов порциями из реакции инициирования по 1 M кротонитрила получа1от соответственно 7 M и 8 M кротонамида (конверсия

100% после 10 и 22 часов соответственно).

Концентрация 8 М соответствует 681 r образованного и накопленного кротонамида в пересчете на 1 литр реакционного раствора.

Кристаллизацию кротонамида проводят так, как указано в примере 4.

Пример 6. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора . содсржащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 M ацетонитрила, после чего при 25 С проводят реакцию с добавлением через 1 час и 3 часа после начала реакции инициирования

3 M ацетонитрила и через б часов еще 5 М ацетонитрила. Через 12 часов после начала реакции получают 12 М ацетамида (конверсия 100%), Другими словами в пересчете на

1 литр реакционного раствора образуется и накапливается 827 г ацетам1лда.

Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугированию. Полученный раствор концентрируют досуха в роторном испарителе, растворяют в метаноле и после кристаллизации иэ метанола получают кристаллический ацетамид.

Пример 7, Суспенэию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 2. добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 M

З-гидроксипропионитрила, после чего проводят реакцию при 25 С с добавлением в реакционный раствор порциями в ЗМ 3-гидроксипропионитрила в общей сложности 4 раза с интервалом в 1 час после начала реакции. Через 5 часов после начала реакции получают 15 M 3-гидроксипропионамида (конверсия 100%). При добавлении на этом этапе дополнительно 3 М 3-г11дроксипропи17

1838416

5

30

55 онитрила в реакционном растворе получают

18 М 3-гидроксипропионамида (конверсия

1/0 спустя 11 часов реакции инициирования). В пересчете на 1 литр реакционного раствора это соответствует 1600 г образованного и накопленного 3-гидроксипропионамида.

Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугированию. Свободный от клеток раствор концентрируют в роторном испарителе и кристаллизуют при

20 С. Кристаллы растворяют в изопропаноле и после кристаллизации из того же растворителе получают кристаллический

З-гидроксипропионамид, Пример 8. В колбу Сакагучи на 1 литр помещают 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды

С, в которую добавлены CoCI2 и кротонамид в количестве соответственно 0,01 и 2 r на литр среды, и смесь культивируют при 28 С на трясучке. Культивирование продолжают с добавлением в культурную среду 0,2Д (масс./об.) кротонамида (800 Mr/400 мл) через 26 и 56 часов после начала культивирования и останавливают через 76 часов, Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1000 g.

20 минут) в цеьтрифужном сепараторе (Хитачи, модель SCR 20 В), промывают 0,85%

NQCI, вновь центрифугируют и суспензируют в 40 мл вышеописанного раствора. Отбирают в качестве образца небольшое количество суспензии и используют для подсчета сухой массы бактериальных клеток в суспензии.

Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,96 мг сухих клеток) добавляют к

4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и

3-цианспирадин в различной концентрации.

В результате 9-ти часовой реакции восемь моли цианопиридина превращены со )00 ой конверсией в никотинамид, девять молей

3-цианопиридина превращены в результате

22 -ух часовой реакции, С другой стороны, при дсбавлении суспензии, содержащей

5,98 мг сухой массы, а не 2,96 мг, как описанном выше опыте, к аналогичному реакционному раствору (4 мл) 9 МЗ„цианопиридина превращают в никотинамид с конверсией 1007 в результате 5-ти часовой реакции, 12 M-3 цианопиридина превращают s результате 9-ти часовой реакции. Образование кислоты не обнаружено.

Никотинамид кристаллизуется из раствора по мере образования, Кристаллы отделяют и перекристаллизовыаают из метанола.

Пример 9. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора. содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 1 М безнитрила и реакцию осуществляют при

25 С, добавляя 1 М бензнитрила соответственно через 1, 2, 3, 4, 5 и 7 часа после начала реакции образуется 7 М бензамидэ с конверсией 100 $ (848 гр/литр).

Пример 10. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют 4 мл реакционного раствора содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (oH 8,0) и 1 M

2,6-дифторбензнитрила, и реакцию осуществляют при 25 С добавляя 1 М 2,6-дифторбензнитрила к реакционному раствору после 2, 4, 6 и 8 часов начала реакции инициирования соответственно.

Спустя 22 часа после реакции инициирования получают 2,5 М (393 гр/лит) 2,6дифторбензамида со 100;, конверсией.

Пример 11. Суспензию бактериальных клеток (соответствующую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1

М 2-тиофенкарбонитрила, и реакцию осуществляют при 25 С, добавляя 1 М 2-тиофенкарбонитрила в реакционный раствор спустя 1 час после начала реакции инициирования. Спустя 5 часов после ее начала получают 2 M (254 г/л) 2-тиофенкарбоксамида СО 100,ь конверсией.

Пример 12. Суспензию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к

4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1

M 2-фуронитрила и реакцию осуществляют при 25 С, добавляя 1 М 2-фуронитрила к реакционному раствору спустя 1, 2, 4, 6. 8, 11 и 23 часа после начала реакции инициирования соответственно. Спустя 30 часов после начала реакции получают 8 M (888 г/литр) 2-фуранкарбоксамида со 1000/ конверсией.

Пример 13. Суспензию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг, сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к

4 мл реакционного раствора, содержащего

10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 4

M 3-индолацетонитрилэ и реакцию осуществляют при 25 С.

Спустя 24 часа после начала реакции инициирования получают 4 М (697 г/л) 3-индолацетамида со 100 конверсией, П р и и е р 14. Клеточную дисперсию, полученную в примере 2 и соответствую1838416

Таблица 1"

СоС!р {мг) FeO4 (мг) Количество клеток

{и г/мл}" 1

1,06

Е/мг* клеток 0

Е/м с{>еды J 0

*1 Количество клеток — в пересчете на сухую массу.

*2 Š— единица активности согласно вышеприведенному определению, количество клеток

Таблица 2

Компоненты во г сукна

Кротонамид

Ацетон итрил

Г1ропионитрил

Бензамид

Г1ропионамид

Ацетамид щую 4,66 мг высушенных клеток, прибавляют к 4 мл реакционной смеси, содержащей

10 MM калийфосфатного буфера {рН 8,0) и 3

М акрилонитрила. и 2 М акрилонитрила далее прибавляют через 0,5,1 и 2 часа после 5 начала реакции. Реакция при температуре

25"С приводит к получению через 8 часов после начала реакции 9 М акрилонитрила, т.е. 640 г/литр, при конверсии 100,ь.

Формула изобретения

1, Способ получения амидов, включающий гидратацию нитрилов при те :;пературе

10-30ОС и рН 7 — 9, в присутствии нитрилгидратазы, полученной в процессе культивиро- 15 вания микроорганизмов родэ Rhodococcus

- процентов нитрилгидратазы, с последуюгцим отделением целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения производительности процесса, в качестве 20 микроорганизмов — продуцентов нитрилгидратазы используют штамм Rhodococcus

thodochrous 1-1 (FERM BP-1478), или АТСС

33278, или ATCC 33025,.а культивирование ведут в присутствии солей кобальта, которые 25 вводят в среду в количестве 5-15 мг/л в пересчете на хлорид двухвалентного кобальта.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что гидратации подвергают алифатический нитрил — акрилонитрил. 30

3. Способ по и, 1, от л и ч а ю шийся тем, что гидратации подвергают ароматический нитрил — бензонитрил, или о-, м- или п-хлорбензонитрил, или о-, м- или и-фторбензонитрил, или м-нитробензонитрил, или п-аминобензонитрил, или о-,м- или и-толунитрил, или 4-цианофенол, или анизонитрил, или фталонитрил, или изофталонитрил, или терефталонитрил, или 2,6-дихлорбе) зонитрил, или 2,4-дихлорбензонитрил, или

2,6-дифторбензонитрил, или а-, или Р-нафToHYiTpMR, 4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что гидратвции подвергают гетероциклические нитрилы-2,-3, или 4-цианопиридин, или 2-тиофенкарбонитрил, или

2-фуронитрил, или 5-цианоиндол, или цианопиразин.

Приоритст по пунктам ф.и.

18.09.87 — по пп. 1-4;

26.03.88 — использование цианопиразина.

Примечание.

П,п. 1, 2, 3, 4 имеют приоритет от

18.09 .87. Признак и, 3, касающийся сипользования для гидратации фторбензонитрила, в котором Ri u Rz — атом фтора, имеет приоритет 16.09.88. Признак и. 4, касающийся использования цранопирЬзина имеет приоритет 26.03.88.

1838416

Продолжение табл,2

Составитель Г. Голева

Техред M. Моргентал Корректор M. Максимишинец

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5