Способ культивирования опорно-зависимых клеточных культур

 

Использование: медицина, сельское хозяйство, биотехнология - технология культивирования тканевых клеток животных и человека. Цель: повышение пролиферативной активности клеток и сокращение периода прикрепления к микроносителю. Сущность изобретения: микроноситель получают путем сополимеризации N, N'-диэтиламиноэтилметакриламида (50-60 мол. %) с N,N'-метиленбисакриламида (40-50 мол. %). Микроноситель представляет собой сферические гранулы белого цвета, плотность гранул 1,15 г/см³, емкость по функциональным группам ДЭАЭ в пределах 1,1-1,5 мг· экв/г, размер пор 500-1000 . Прикрепление клеток к микроносителю проводят в режиме культивирования при перемешивании со скоростью 15-20 об/мин. 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к технике культивирования тканевых клеток животных и человека, и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве, вирусологии, онкологии, для получения клеточной биомассы, в производстве биологически активных веществ (интерферона, гормонов, антител, ферментов и т.д.) вакцин и сывороток. Одним из перспективных методов культивирования клеток животных и человека является культивирование на микроносителях, который обеспечивает высокое качество конечных продуктов клеточного и вирусного происхождения [1] Преимущество этого метода состоит в том, что он сочетает монослойное и суспензионное культивирования, позволяя использовать разработанные для суспензий аппаратурно-технические конструкции, и обеспечивает большую развитую поверхность (по отношению к объему) для выращивания. Метод с использованием микроносителей позволяет получать более гомогенную клеточную и вирусную продукцию. Применение культиваторов спиннерного типа сокращает при этом количество манипуляций при работе, уменьшает риск контаминации культуры, облегчает процесс выращивания клеток и значительно экономит энергоресурсы. Использование оборудования для суспензионного культивирования облегчает контроль за условиями выращивания клеток, обеспечивается смена питательной среды без значительных потерь микроносителя и клеток при кратковременном отстаивании и концентрировании клеточных суспензий. Важное значение имеет также возможность применять практически любые клеточные системы без предварительной адаптации. В то же время метод имеет ряд недостатков. Так, микроносители обычно используются однократно, требуют длительной обработки, не выдерживают повторной стерилизации. Отмечается [1,2] что на некоторых из микроносителей не всегда обеспечиваются стабильные результаты, особенно это касается стадии прикрепления клеток к микрогранулам, а также представляет определенные трудности процесс субпассирования клеток. К числу широко применяемых относятся микроносители с положительным зарядом поверхности, в частности, содержание диэтиламиноэтильные (ДЕАЕ) группы [3] Ионообменный декстран ДЕАЕ-Sephadex A-50 с размером гранул 60-100 мкм в концентрации 1 г/л был использован для культивирования перевиваемых клеточных линий, первичных клеток почек кролика и диплоидных клеток человека. Однако дальнейшее увеличение количества микроносителя в среде не обеспечивало повышения выхода клеток в связи с их токсичностью. Прототипом изобретения является способ культивирования на микроносителе [4] представляющем собой тройной сополимер состава: N,N'-диметиламинопропилметакриламид (20-40%) катионсодержащий мономер; N,N'-метиленбисакриламид (3-10%) сшиватель; акриламид (40-75%) гидрофильный мономер. Сополимеризация мономеров проводилась в 0,1 н. водном растворе NaCl, в суспензии в хлороформе, для выделения и отмывки гранул использовался метанол. Полученные таким способом мягкие микросферические гели по свойствам аналогичны ДЕАЕ-целлюлозе фирмы BioRad (Cellex D). Культивирование на этом микpоносителе клеток Vero (почки африканской зеленой мартышки) проводят в среде Игла с добавлением антибиотиков при концентрации микроносителя 5 г/л при посевной дозе 2 · 10⁵ клеток/мл. Процесс проводят в две стадии: на первой осуществляется прикрепление клеток к носителю при слабом перемешивании (1-2 об/мин) в течение суток, после чего включают режим культивирования, увеличивая скорость перемешивания до 15-20 об/мин. Удвоение урожая наблюдали через 65 ч, а через 16 сут урожай клеток составил 7 · 10⁵ клеток/мл (индекс пролиферации равен 3). К недостаткам этого способа культивирования относятся: низкая пролиферативная активность клеток; длительность процесса прикрепления; сложная технология получения микроносителя с использованием многокомпонентной системы мономеров и токсичных растворителей (хлороформ, метанол). Целью изобретения является разработка способа культивации с повышением профилеративной активности клеток и сокращением периода прикрепления клеток к микроносителю. Указанная цель достигается использованием микроносителя, получаемого путем сополимеризации 50-60 моль. N,N'-диэтиламиноэтилметакриламида (ДЕАЕ) с 40-50 мол. N,N'-метиленбисамида (МБА), и проведением стадии прикрепления в режиме культивирования. Существенным отличием заявляемого способа является новая структура микроносителя, позволяющая эффективно прикреплять живые клетки, причем из-за высоких скоростей посадки и повышенных сорбционных свойств прикрепление определяется возможностью контакта клетки с носителем, т.е. требует более высоких степеней перемешивания, скорость которых ограничивается на верхнем пределе отсутствием повреждающего механического действия мешалки. При более низких скоростях мешалки эффективность процесса снижается из-за большего времени, требующегося для посадки клеток. Использование новой совокупности признаков позволяет резко снизить время культивирования клеток и повысить их пролиферативную активность. Сопоставление методов культивирования pазличных клеток в известных условиях и при культивировании на новых сорбентах, получивших наименование "Ольвагели", приведены в примерах. П р и м е р 1. Методика получения микроносителя "Ольвагель" (60/40). В стеклянной емкости на 500 мл приготавливали раствор ДЕАЕ-метакриламида (26 ч) (60 мол.) в растворе хлористого натрия (360 ч). В раствор вводили N, N'-метиленбисакриламид (14 ч) (40 мол.) и инициатор персульфат аммония (0,8 ч). В термостатируемый реактор, снабженный механической мешалкой, холодильником и трубкой для барботирования аргона, помещали тридекан (600 ч), содержащий СПАН, и вводили реакционную смесь, приготовленную в стеклянной емкости при непрерывном перемешивании со скоростью 300 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, далее включали обогрев реактора до 70^oC. Процесс сополимеризации проводили в течение 3 ч. Гранулы отмывали от тридекана водой с детергентом, дистиллированной водой и рассеивали на ситах, выделяя фракцию 100-200 мкм. П р и м е р 2. В условиях примера 1 синтезировали микроносители с различным соотношением компонентов (в числителе ДЕАЕ, в знаменателе МБА). Результаты культивирования pазличных культур приведены в табл.1. Более подробно условия культивирования приведены в последующих примерах. Микроноситель представляет собой сферические гранулы белого цвета, плотность гранул 1,15 г/см³, емкость по функциональным группам ДЕАЕ в пределах 1,1-1,5 мг·экв/г; имеет магистральные поры размером 500-1000 Микроносителю присвоено название Ольвагель. Оценку эксплуатационных характеристик микроносителей проводили на клетках линии Vеro. Культивирование велось в модифицированных ферментах F-2000 фирмы NBS. Подготовка и стерилизация микроносителей осуществлялась в соответствии с рекомендациями фирмы "Фармация" для микроносителей типа "Цитодекс". В качестве контроля при культивировании использовали микроносители Цитодекс-1. Условия проведения экспериментов: Объем заполнения ферментера культуральной жидкостью 1,0 л. Концентрация микроносителя 5,0 г/л. Посевная концентрация клеток 0,3-0,5 млн/мл. Аэрирование поверхностное, переменное. Состав культуральной жидкости: среда Игла НЕМ, 90% сыворотка КРС, 10%
глютамин, 0,6 г/л;
антибиотики. Учет результатов проводили по максимальной концентрации клеток через 4 сут. Результаты культивирования см. в табл.2. П р и м е р 3. Культивирование фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) на микроносителях. 2,3 мл гидратированного осадка микроносителей Ольвагель, аналога Цитодекс-2 и прототипа ДЕАЕ-полиакриламидный гель, обеспечивающий культуральную поверхность 825 см² для 0,6 · 10⁶ свежеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста культивируют в 50 мл питательной среды 199 без добавления глютамина, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики. Культивирование клеток на микроносителях Ольвагель и аналога проводили 4 сут, на прототипе 9 сут в сосуде объемом 150 см³ при перемешивании со скоростью 15-20 об/мин и ежедневной смене питательной среды на 50% начиная с вторых суток культивирования. Количество клеток ФЭК в 1 мл в конце культивирования (урожай клеток) на микроносителях Ольвагель составляло 2,1 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 3,5) (табл. 3)). Аналогичные результаты были получены при культивировании клеток ФЭК на микроносителе-аналоге (индекс пролиферации клеток 3,2). При культивировании клеток на микроносителе-прототипе количество клеток в конце культивирования (96 ч) было 0,7 · 10⁶ клеток в 1 мл (индекс пролиферации 1,2). При более длительном культивировании клеток ФЭК (216 ч) на микроносителе-прототипе (табл. 3) не удалось достичь индекса пролиферации клеток, полученного при их культивировании на микроносителе Ольвагель в течение 96 ч (2,1 против 3,5). Использование микроносителя Ольвагель для культивирования клеток ФЭК позволяет сократить время прикрепления клеток к микроносителю более чем в 5 раз по сравнению с прикреплением клеток на прототипе (табл.3), при использовании Ольвагеля более чем на сутки сокращается время удвоения количества клеток и увеличивается их окончательная концентрация в конце культивирования. П р и м е р 4. Культивирование диплоидных фибробластоподобных клеток эмбриона человека. Культивирование проводят, как в примере 3, с той разницей, что для 2,3 мл осадка микроносителей площадь их культуральной поверхности 825 см², берут посевную концентрацию клеток 0,15 · 10⁶ кл/мл. Урожай клеток на пятые сутки (табл. 3) в объеме культивирования составлял на микроносителе Ольвагель 0,87 · 10⁶ клеток в 1 мл (индекс пролиферации 5,8). При культивировании на аналоге урожай был 0,8 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 5,4), на прототипе 0,49 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 3,3). При культивировании клеток на Ольвагеле было показано, что по отношению к прототипу здесь на 3 ч меньше время прикрепления клеток и в 2 раза меньше время удвоения клеток при более высоком индексе пролиферации в конце культивирования. Даже при культивировании на 5 сут дольше (216 ч) на прототипе не был получен результат, получаемый на Ольвагеле на четвертые сутки (через 96 ч). Соответственно индексы пролиферации 4,2 и 5,8. П р и м е р 5. Культивирование перевиваемых клеточных линий на микроносителях. Культивирование перевиваемых клеточных линий Vero проводили: как описано в примере 3, с той лишь разницей, что для 2,3 мл осадка микроносителей, обеспечивающих площадь поверхности 825 см², брали посевную концентрацию клеток Vero 0,3 · 10⁶ кл/мл, а Нер-2 и L-41 0,2 · 10⁶ кл/мл. Урожай клеток Vero в объеме культивирования на микроносителях Ольвагель на 4 сут (96 ч) составлял 2,02 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 6,7) (табл. 3), на аналоге Цитодекс-2 1,7 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 5,9), на прототипе 0,7 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 3,5). При культивировании клеток Нер-2 на микроносителях Ольвагель их урожай составлял 0,8 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 3,9), на прототипе 0,24 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 2,4). Урожай клеток L-41 при культивировании их на микроносителях Ольвагель был на 4 сут культивирования 0,6 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 3,5), на аналоге 0,58 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 2,9), на прототипе 0,26 · 10⁶ кл/мл (индекс пролиферации 1,3). На пpототипе клетки Vero культивировали в течение 16 сут (384 ч), однако не были достигнуты результаты культивирования клеток в течение 5 сут (120 ч), на микроносителе Ольвагель. Соответственно индексы пролиферации 3,5 против 6,7. Как видно из приведенных примеров, при культивировании широкого круга клеток на микроносителях Ольвагель удается при сокращении времени культивирования в 1,5-2,0 раза получить повышенный урожай биомассы.

Формула изобретения

Способ культивирования опорно-зависимых клеточных культур, предусматривающий прикрепление клеток к микросферическим носителям, полученным сополимеризацией катионного мономера с акриламидным сшивателем, и выращивание при 40 60°С при перемешивании со скоростью 15 20 мин^-1, отличающийся тем, что, с целью сокращения периода прикрепления клеток и повышения их пролиферативной активности, в качестве микроносителя используют сополимер с содержанием 50 60 мол. катионного мономера и 40 50 мол. акриламидного сшивателя N,N'-метиленбисакриламида, при этом в качестве катионного мономера используют N,N'-диэтиламиноэтилметакриламид, а прикрепление клеток ведут в условиях режима выращивания.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 28-2000

Извещение опубликовано: 10.10.2000        

---