Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к фикомицетам рода рнyторнтоrа, штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к фикомицетам рода рнyторнтоrа, способ получения моноклональных антител к фикомицетам рода рнyторнтоrа

 

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, диагностика заболеваний растений. Сущность изобретения: получают гибридный штамм Balb Maus/Sp2 Myelom # РН 4830, продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к антигенам фикомицетов Phytophtora megasperma f.sp. medlcagmls. Самок мышей линии Balb/c.1 в возрасте 4-5 нед. иммунизируют антигенными препаратами мицелия P. megasperma f. sp. megicaginis, иммунные спленоциты сливают с клетками миеломы 2-0 Ад 14 и отбирают необходимую гибридому путем иммуноферментного анализа. Клонирование гибридомы осуществляют методом лимитирующих разведений. МКА относятся к подклассу lgC2b. Их выделяют из культуральной и асцитной жидкости на хроматографической колонке с протеин А-сефарозой. Концентрация МКА в асцитной жидкости составляет 3 мкг/мл, в культуральной 16 мг/мл, 3 с. п. ф-лы, 1 табл. In

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356286/13 (22) 22.07.88 (46) 23.08,93. Бюл, М 31 (31) 77.616 (32) 24.07.87 (33) US (71) Циба-Гейги АГ (СН) (72) Фрэнк Петерсон, Салли Миллер и

Джеймс Риттенбург (US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМЫ, ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ

АНТИТЕЛА К ФИКОМИЦЕТАМ РОДА

PHYT0PHTORA, ШТАММ ГИБРИДНЫХ

КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS

MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ФИКОМИЦЕТАМ РОДА

PHYT0PHT0RA, СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ФИКОМИЦЕТАМ РОДА PHYTOPHTORA

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для диагностики заболеваний растений.

Для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (MKA) к фикомицетам рода Phytophtora, мышей линии

Balb/c иммунизируют антигенным препаратом мицелия гриба Phytophtora megasperma

f, sp. glycinea, затем выделяют иммунокомпетентные клетки селезенки, сливают их с клетками миеломы Sp 2-0-Ag.14, осуществляют скрининг гибридом с помощью иммуноферментного метода и отбирают нужную

„„ Ж„„1836421 АЗ

s С 12 N 5/00, А 61 К 39/00 (57) Использование: сельскохозяйственная биотехнология, диагностика заболеваний растений. Сущность изобретения: получают гибридный штамм Balb Maus/Sp2 Myeloma

Ф РН 4830, продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к антигенам фикомицетов

Phytophtora megasperrna f.sp. medicaglnis.

Самок мышей линии Balb/c.1 в возрасте 4-5 нед, иммуниэируют антигенными препаратами мицелия P. megasperma f. sp.

megicaginis, иммунные спленоциты сливают с клетками миеломы 2 — 0 Ag 14 и отбирают необходимую гибридому путем иммуноферментного анализа. Клонирование гибридомы осуществляют методом лимитирующих разведений. MKA относятся к подклассу IgC2b. Их выделяют из культуральной и асцитной жидкости на хроматографической колонке с протеин А-сефарозой.

Концентрация MKA s асцитной жидкости составляет 3 мкг/мл, в культуральной 16 мг/мл, 3 с. и. ф-лы, 1 табл. гибридому. Гибридные клетки выращивают в культуральной,среде или в организме жиBoTHbix, затем культуральную среду или асцитную жидкость очищают на колонке с протеин А-сефароэой и выделяют igG2b, Штамм Baib Maus/Sp Муе!овФРН 4830 получают следующим образом, Самок мышей линии Batb/сЛ в возрасте

4 — 5 нед. иммуниэируют антигенными препаратами мицелия грибов Phytophtora вецаэрегта f. sp.glycinea. Первую инъекцию проводят интраперитонеально в объеме 0,2 мл с добавлением адьюванта

1836421

Фрейнда, вторую — через 11. мес. аналогичным образом. Спустя 7 дней после последней инъекции животное умерщвляют путем перелома шейного отдела позвоночника.

Селезенку удаляют и помещают в 20 мл мо- 5 дифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM). Далее селезенку расправляют на стерильном решетчатом сите (80 меш), разрезают. ополаскивают 0MEIVI и затем слегка массируют с помощью одноразового шприца емкостью 10 смз.

Во время экстракции клеток селезенки решетчатое сито постоянно ополаскивают

ОМЕМ. Суспензию клеток вносят в одноразовые пробирки для центрифугирования емкостью 50 мл и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин (центрифугирование осуществляют при комнатной температуре).

Надосадочную жидкость отбрасывают, 20 клеточный осадок промывают 10 мл лизирующего эритроциты раствора (0,83,(NH4O, 0,01 М КНСОз, 0,1 мМоль ЕОТА) в течение

90 с при комнатной температуре.

Реакцию лизирования останавливают 25 разбавлением раствора с помощью 40 мл

ОМЕМ.

Пробу оставляют на 3 мин и затем насадочную жидкость пипеткой вносят в 50 мл пробирки для центрифугирования. После 30 центрифугирования осадок клеток промы- . вают 50 мл ОМЕМ и снова центрифугируют.

Оставляют небольшую пробу клеток селезенки для подсчета и определения жизнеспособности, Получают 7х10 клеток 35 селезенки в 5 мл раствора. Клетки миеломы

SP2-О-Ag 14 переносят из культуры в стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки емкостью 50 мл (7х10 клеток).

Затем их центрифугируют в течение 10 мин 40 при комнатной температуре и 1200 об/мин.

После центрифугирования надосадочную жидкость помещают в чистый стеклянный стакан, клетки промывают ОМЕМ и снова центрифугируют. В пробирки с промытыми 45 клетками миеломы добавляют клетки селезенки. Затем клетки миеломы и селезенки осторожно с помощью пипетки на 10 мл снова суспендируют и центрифугируют 10 мин при 1200 o6/мин и комнатной темпера- 50 туре, Надосадочную жидкость отбрасывают, Среду для слияния и ПЭГ 1500 подогревают до 37 С, 1 мл среды для слияния по каплям добавляют в пробирку с ресуспендированными клетками миеломы и 55 селезенки. В последние 7 мин реакции слияния ПЭГ постепенно разбавляют с помощью РМЕМ. По окончании разбавления общий объем жидкости в пробирке составляет примерно 30 мл.

10 мл

38,8 мг

136,1 мг

Во время всей процедуры слияния пробирку слегка перемещают для того, чтобы обеспечить перемешивание находящегося в ней материала, Затем пробирку центрифугируют (1200 об/мин, 10 мин при комнатной температуре) и надосадочную жидкость удаляют, B пробирку добавляют 33 мл подогретой ГАТсреды (ГАТ от гуанин, аминоптерин, тимидин) и снова ресуспендируют клеточное содержимое с помощью пипетки емкостью

10 мл, Клетки распределяют в 96-луночных панелях для микротитрования, В каждую лунку вносят I50 мкл суспензии клеток, Затем лунки заполняют ГАТ-средой. Панели для микротитрования инкубируют во влажной атмосфере 7 (-ного СО2 при температуре 37 С. Затем клетки в течение 4 дней выращивают в свежей ГАТ-среде следующего состава:

DMEM 766 мл

1=глутамат 10 мл пенициллин или стрептомицин (10 000 единиц) 100 мл ГАТ 10 мл аминоптерин (2х10-5М раствор) 4мл

Гипоксантин/ тимидин

1 н. Na0H тимидин гипоксантин в 100 мл стерильной воды эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота 200 мл.

Первые клоны гибридных клеток начинают появляться спустя 7-10 дней, Скрининг гибридом осуществляют следующим образом, 20 мкл содержащего глутаровый альдегид буфера помещают в каждую лунку культуральной панели и инкубируют 3 ч при

55 С, Панель охлаждают до комнатной температуры и оставшийся буфер отбрасывают.

Панели промывают 4 раза дистиллированной водой. 200 мкл антигена, разбавленного в PBS, рН 7,2 (концентрация антигена 10 мкгlмл) распределяют по отдельным лункам и инкубируют 24 ч при 4 С. Оставшийся раствор отбрасывают, панели промывают 8 раз с помощью PBS. Затем в каждую лунку вносят 200 мкл раств8ра моноэтаноламина и инкубируют следующие 20 ч при 4 С.

Оставшийся раствор отбрасывают, а панели 8.раз промывают с помощью PBS, 100 мкл надосадочной жидкости гибридомы, содержащий антитела, помещают в каждую лунку и инкубируют 2 ч при 33 С и высокой влажности воздуха, Оставшийся раствор отбрасывают, а панели 8 раз промывают.РВ5.

1836421

20

30

45

55

Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл биотинированного конъюгата, содержащего lg козы к антителэм мыши и стрептовидинпероксидаэу, Инкубируют при 37 С и высокой влажности воздуха в течение 0,5 ч, далее раствор отбрасывают и панели 8 раз промывают PBS, Надосадочный раствор сливают и панель промывают 8 раэ с помощью PBS. В каждую лунку помещают 200 мкл субстрата ортофенилендиамина и инкубируют в течение 0,5 ч при комнатной температуре. Затем определяют абсорбционную емкость в красной области спектра при 405 нм. Показатель менее 0,2 считают отрицательной реакцией.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что полученные гибридные клетки продуцируют МКА к антигенам фикомицетов рода Phytophtora. особенно к Р.

megasperma f. sp. medicaginis, P, capsici, P, megasperma f. sp. glucinea, Р. citricola и Р.

megasperma. Штамм, продуцирующий антитела необходимой специфичности, выводят в массовую культуру и обозначают как Balb

Maus/Sp2 Myelom PH 4830. Клонирование и субклонирование штамма осуществляют методом лимитирующих разведений.

Штамм характеризуется следующими признаками, Культуральные признаки. Для выращивания гибридомы используют среду DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина, антибиотиков, тимидина, гипоксантина, 125 мл среды наливают в культуральный флакон объемом 750 мл, вносят 10х10 клеток гибридомы и инкубируют в горизонтальном положении в атмосфере 67;-ного СОг при 370С. Среда истощается через 10 — 14 дней. Для получения МКА в виде асцитной жидкости самок мышей линии Balb/c возраст от 6 до 8 недель внутрибрюшинно иммунизируют клетками гибридомы (0,5x10 . которые ресуспендируют в 0,5 мл среды DMEM. 3a две недели до этого мышам вводят 0,5 мл пристана. Асцит образуется в течение 10.-14 дней. Затем животным дают наркоз и в результате пункции отбирают 3 мл асцитной жидкости. Общее количество асцитной жидкости, которое можно собрать от каждого животного составляет 5-6 мл. Продуктивность штамма, Концентрация МКА в асцитной жидкости составляет 3 мкг/мл, в культуральной — 16 мкг/мл, Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к подклассу IgG2b. Аффинность МКА составляет 4,3 мкг/мл антигена при 507, максимального значения оптической плотности. Антитела специфически реагируют с антигенами фикомицетов

P.megasperma f. sp. medicaglnis.

Использование изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Самок мышей линии Balb/с возрастом от 6 до 8 недель подготавливают внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл пристана для последующей инъекции клеток гибридомы. Затем чеоез 2 нед. животным вводят 0,5х10 клеток гибридомы в 0,5 мл

ДМЕМ, Через 10 — 14 дней животным дают наркоз и собирают асцитную жидкость, Антитела класса IgG2b получают путем хроматографии на протеин А-сефарозе при следующих параметрах:

1, Протеин А/сефароза (6,0 мл)

2. Трис/HCI уравновешивающе-связывающий буфер, рН 8,6.

3. Ацетатный Отмывающий буфер. рН

4,3

4. Глицин/HO регенерационный буфер, рН 2,3.

5. Скорость прохождения через колонку — 1 мл/мин.

6. Загрузка колонки — 2,5 мл неочищенной дсцитной жидкости.

Асцитную жидкость пропускают через колонку и элюируют фракцию!д62Ь при рН

4,3. Активность полученных антител on ределяют иммуноферментным методом.

Пример 2. Выделенные из асцитной жидкости МКА конъюгируют с пероксидазой хрена и используют для выявления антигенов Р. megasperma f. sp. medicaginis в тканях растений сои, Для этого пробы выращиваемых в грунте соевых растений как с симптомами, так и без симптомов корневой и стеблевой гнили, эстрэгируют и испытывают иммунологическим путем в реакции с конъюгатом MKA-пероксидаэа хрена, как описано выше, Результаты исследований представлены в таблице.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что полученный штамм Balb Maus/SP2 Муе! ОгпФрН 4830 продуцирует МКА, специфически реагирующие с антигенэми Phytophtora megasperma f, sp.

rnedicaginls. Такие антитела могут быть эффективно использованы для быстрой диагностики заболеваний растений и распознавания скрытых видов патогенных фикомицетов в растениях.

Формула изобретения

1. Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклонэльные антитела к фикомицетам рода Phytophtora, заключающийся в том, что мышей линии Вэ!Ь/с иммунизируют экстрактом мицелия Phytophtora

megasperrna f. sp. glycinea, выделяют имму1836421

Составитель M.Ñåðîâà

Техред М, Моргентал Корректор А.Мотыль

Редактор О.Кузнецова

Заказ 3007 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 нокомпетентные клетки селезенки, слива рт их с клетками миеломы, проводят скрининг, отбирают гибридому ATCC НВ 9353 и при необходимости ее клонируют и реклонируюТ.

2. Штамм гибридных культивируемых 5 клеток Mus museufus L. АТСС НВ 9353, используемый для получения моноклональных антител к фикомицетам рода

РЬу орптога.

3, Способ получения моноклональных антител к фикомицетам рода Phytophtora, заключающийся в том, что гибридому АТСС

НВ 9353 выращивают в культуре или в живом организме, а моноклональные антитела, относящиеся к. подклассу IgG2b, выделяют из культуральной или асцитной жидкости путем хроматографической очистки,