Галоидсодержащие 3'-амидопроизводные(1'r,5'r)-3' -аза-1'- (2-амино-1,6- дигидро-6- оксопуринил-9) -3'- дезоксигексопиранозил -6'- бензоата в качестве специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов рнк- полимеразы

 

Использование: в качестве специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов РНК-полимеразы. Сущность изобретения: продукт (1ʹR, 5ʹR)-3ʹ аза 1ʹ (2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9) 3ʹ дезокси 3ʹ [5-(диметиламино)нафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил 6ʹ (4-фторсульфонил)бензоат] выход 42% БФ C₂₉H₂₉FN₈₀O₈S₂, т.пл. 170 172°С (разл.); продукт: (1ʹR, 5ʹR)-3ʹ аза 1ʹ (2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9) 3ʹ дезокси 3ʹ [5-(диметиламино)нафталин-1-сульфамидо]гексопиранозил 6ʹ [4-(бромметил)бензоат] выход 51% БФ C₃₀H₃₁BrN₈O₈S, т.пл. 176 178°С (разл.); продукт: (1ʹR, 5ʹR)-3ʹ аза 1ʹ (2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9) 3ʹ дезокси 3ʹ (2-гидроксибензамидо)гексопиранозил 6ʹ [4-(фторсульфонил)бензоат] выход 38% БФ C₂₄H₂₂FN₇O₁₀S, т.пл. 160°С (разл.). Продукт: (1ʹR, 5ʹR)-3ʹ аза 1ʹ (2-амино-1,6-дигидро 6ʹ оксопуринил-9) 3ʹ дезокси 3ʹ (2-гидроксибензамидо)гексопиранозил 6ʹ [4-(бромметил)бензоат] выход 43% C₂₅H₂₄BrN₇O₈, т.пл. 168 170°С (разл.) 1 табл.

Изобретение относится к новым химическим соединениям галоидсодержащим 3'-амидопроизводным (1'R, 5'R) -3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-де-зоксигексопиранозил- 6'-бензоата общей формулы I: R-O где R₁ FSO₂ или BrCH₂- R₂= или в качестве специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов РНК-полимеразы.

Соединение общей формулы I могут найти применение в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для изучения строения и механизма действия РНК-полимеразы с помощью спектрофлуориметрии.

Наиболее близким к описываемым является известное соединение (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезокси-3'- (2-гидроксибензамидо)гексопиранозил-6'-трифосфат (V), который оказывает специфическое ингибирующее действие на РНК-полимеразу и обладает флуоресцентными свойствами.

Однако данное соединение оказывает недостаточно эффективное ингибирующее действие на фермент и не содержит в составе молекулы реакционноспособной группировки, что существенно ограничивает область его применения.

Целью описываемого изобретения является поиск новых соединений в ряду галоидсодержащих 5'-замещенных 3'-амидопроизводных (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозы оказывающих эффективое ингибирующее действие на РНК-полимеразу и обладающих флуоресцентными свойствами.

Цель достигается описываемыми новыми химическими соединениями галоидсодержащими 3'-амидопроизводными (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксоп- уринил-9)-3'- дезоксигексопиранозил-6'-бензоата вышеприведенной общей формулы I в качестве специфических необратимых флуоресцентных игнибиторов РНК-полимеразы.

Описываемые соединения общей формулы I получают способом, основанным на известной реакции диальдегидного производного, полученного периодатным окислением соответствующего 5'-замещенного рибонуклеозида с моноацилгидразином и заключающимся во взаимодействии окисленных периодатом натрия гуанозин-5'-[4-(фторсульфонил- или бромметил)бензоата] с гидразидами 2-гидроксибензойной или 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфокислоты в литий-ацетатном буфере при рН 5.

П р и м е р 1. (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксо-пуринил-9)-3'-дезок- си- 3'-/5-(диметиламино)нафталин-1-сульфамидо/гексопиранозил-6'-/4- (фторсульфонил)бензоат [1] К раствору 47 мг (0,22 ммоль) периодата натрия в 0,5 мл воды при 4^оС и интенсивном перемешивании приливают раствор 94 мг (0,2 ммоль) гуанозин-5'-/4-(фторсульфонил)-бензоата/ в 1 мл смеси вода-диоксан (2:3, об.). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от света, затем добавляют ≈0,05 мл этиленгликоля и дополнительно перемешивают в течение 0,5 ч. После этого к реакционной смеси добавляют ≈1 мл безводного этанола, полученную суспензию охлаждают до температуры 4^оС и центрифугируют. Супернатант отделяют и упаривают при пониженном давлении до объема ≈0,2 мл. Остаток смешивают с 1 мл охлажденного безводного этанола, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Супернатант представляет собой раствор диальдегидного производного аденозин-5'-[4-фторсульфонил)бензоата] который без дополнительной очистки используют на следующей стадии.

К вышеуказанному раствору диальдегидного производного прибавляют ≈0,05 мл 3 М литий-ацетатного буфера (рН 4,5) и затем при интенсивном перемешивании раствор 53 мг (0,204 ммоль) 5-(диметиламино)нафталин-1-сульфогидразида в 2 мл диоксана. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, упаривают при пониженном давлении до объема ≈1 мл, добавляют 2 мл воды и оставляют при 4^оС на 15 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, перекристаллизовывают из смеси диоксан-этанол-вода, высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 61 мг целевого продукта (выход 42%).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице.

П р и м е р 2. (1'R, 5'R)-3'-Аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезок-си-3'-/5- (диметиламино(нафталин-1-сульфамидо/гексопиранозил-6'-/4-(бромметил) бензоат/ (II).

В условиях, аналогичных описанным в примере 1, используя 96 мг (0,2 ммоль) гуанозин-5'-[4-(бромметил)бензоата] получают 76 мг целевого продукта (выход 51%).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице.

П р и м е р 3. (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезок-си-3'- (2-гидроксибензамидо)гексопиранозил-6'-/4-(фторсульфонил)бензоат/ (III).

В условиях, аналогичных описанным в примере 1, используя 32 мг (0,21 ммоль) 2-гидроксибензамида, получают 49 мг целевого продукта (выход 38%).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице.

П р и м е р 4. (1'R, 5'R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6-дигидро-6-окопиринил-9)-3'-дезокси-3'- (2-гидроксибензамидо)гексопиранозил-6-[4-(бромметил)бензоат] (IV).

В условиях, аналогичных описанным в примере 1, используя 96 мг (0,2 ммоль) гуанозин-5'-/4-(бромметил)бензоата/ и 32 мг (0,21 ммоль) 2-гидроксибензамида, получают 54 мг целевого продукта (выход 43%).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в таблице.

Изучение ингибирующего действия описанных соединений на РНК-полимеразу проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамм-продуцента E.Coli известным способом. Активность фермента определяли по образованию [³²P] РНК из [³²P] нуклеозид-5'-трифосфатов.

Смесь для преинкубации фермента с ингибитором (общий объем 10 мкл) содержит 50 мМ Трис-НСl (рН 7,8); 10 мМ 5 мМ LiCl; 10 мМ меркаптоэтанол; фермент 0,2-0,5 мкг в пробе; изучаемое соединение в виде 10 мМ раствора в диметилформамиде вносят в среду для получения раствора требуемой концентрации (0,4 мМ). Параллельно ставят контрольную пробу на ингибирующее действие диметилформамида в отсутствие ингибитора. Преинкубацию фермента с ингибитором проводят при комнатной температуре. Через определенные промежутки времени (5-30 мин) к пробам добавляют по 15 мкм смеси, содержащей (в том же буферном растворе): плазмиду PGEM-2 ("Promega Biochem, США) 20-40 мкг/мл АТФ УТФ, ЦТФ и ГТФ по 0,4 м/моль/мл [α-³²P] АТФ или [α-³²Р] УТФ (200000 имп./мин на пробу). Реакцию проводят при 37^оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение К_каж определяли из графика зависимости ln A_i/A_o от времени преинкубации t, где A_i и A_о активность фермента в присутствии и в отсутствие ингибитора, соответственно.

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000-160000 ед. и характеризуется следующими значениями К_m для нуклеозид-5'-трифосфатов: K_m ГТФ 0,16 мМ, K_m АТФ 0,04 мМ, K_m ЦТФ 0,08 мМ, K_m УТФ 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы описываемыми соединениями увеличивается с течением времени и не уменьшается после их удаления из среды преинкубации (диализ), что указывает на необратимое связывание ингибитора с ферментом, При совместной преинкубации соединений I-IV с ГТФ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдают защитный эффект от действия ингибиторов, что указывает на их специфическое взаимодействие с активным центром фермента. Ингибирование РНК-полимеразы соединениями I-IV в концентрации 0,4 мМ охарактеризовано константами К_каж.

Для описываемых соединений I,II,III и IV К_каж 0,14, 0,10, 0,04 и 0,08 мин^-1 соответственно.

Описываемые соединения I-IV оказывают выраженное необратимое ингибирующее действие на РНК-полимеразу. Известное соединение V является обратимым ингибитором данного фермента (К₁0,9 мМ).

Формула изобретения

Галоидсодержащие 3'-амидопроизводные (I', R, 5' R)-3'-аза-1'-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9)-3'-дезоксигексопиранозил-6'-бензоата общей формулы где R₁ FSO₂ или BrCH₂; в качестве специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов РНК-полимеразы.

РИСУНКИ

Рисунок 1