Способ определения уровня мембраносвязанной каталазы эритроцитов

 

Использование: медицина, может быть использовано в лабораторных исследованиях и мембраннологии. Сущность изобретения: у пациента берут пробу крови, получают гемолизат, измеряют общую активность каталазы гемолизата, затем гемолизат центрифугируют с последующим определением активности каталазы супернатанта и расчетном уровня мембраносвязанной каталазы путем вычисления разности первого и второго показателей и выражения этой разности в процентах от общей активности каталазы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторных исследованиях и мембранологии.

Аналогами служат способы определения активности каталазы крови, позволяющие оценить суммарное значение активности данного фермента, характеризующее состояние ее антиоксидантных реакций.

Вместе с тем, согласно современным представлениям, надежность функционирования антиоксидантной защитной системы обеспечивается ее многоступенчатым и многофакторным характером, и в ней задействованы, кроме каталазы, супероксиддисмутаза, глютатионпероксидаза, глютатионредуктаза, а также витамины А, Е, С и другие соединения. Следовательно, изучение лишь одного звена этой сложной системы не может дать полного представления о ее состоянии, а охват всех перечисленных компонентов в рамках одного исследования является весьма трудоемким. Поскольку конечным результатом действия антиоксидантной защитной системы крови является состояние клеточных мембран, целесообразно найти подходы, позволяющие выявлять изменение их характеристик в качестве признака антиоксидантного неблагополучия.

Одним из таких подходов может быть определение мембраносвязанной каталазы, поскольку из литературы известно, что эта связь лабильна и зависит от структурно-функционального состояния клеточных мембран.

В качестве прототипа принимается способ определения активности стромальной каталазы, заключающийся в том, что эритроциты гемолизируют, выдерживают сутки в холодильнике, центрифугируют, осадок многократно отмывают раствором КСl до тех пор, пока надосадочная жидкость не перестает расщеплять перекись водорода, и затем известным методом Баха определяют каталазную активность стромы эритроцитов, выражая ее в мг разложившейся Н₂О₂.

Установлено, что после обработки мембран раствором КСl в них остается лишь 19% активности каталазы от ее первоначальной величины, и полученный описанным способом показатель не будет достаточно точно отражать степень связывания указанного фермента с мембраной эритроцита.

Целью изобретения является повышение точности способа при одновременном упрощении. Это достигается за счет того, что определяют долю мембраносвязанной каталазы, выраженную в процентах от общей активности гемолизата.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования в объеме 0,02 мл берут из пальца и гемолизируют в 1,0 мл дистиллированной воды с добавлением 5% -ного раствора лимоннокислого натрия в соотношении 6:1 (рН рабочего раствора 7,6). Определяют показатели активности каталазы гемолизата и супернатанта после центрифугирования последнего в течение 15 мин при 3000 об/мин модифицированным методом gross Von J. et al. 1975. Разность полученных показателей, составляющую активность осадка, т.е. мембран, выражают в процентах от общей активности гемолизата.

Для доказательства достижения положительного эффекта повышения точности, способ апробирован на образцах крови практически здоровых людей и онкологических больных, т.е. группах, аналогичных тем, которые были обследованы согласно прототипу.

Оба способа однозначно выявляют снижение активности мембраносвязанной каталазы у онкологических больных, однако, если по способу-прототипу это снижение было в 1,4 раза (каталазное число составило 13,48 в контроле и 9,35 в опыте), то по предлагаемому способу кратность снижения составила 2,1 раза (20,7% и 9,7% соответственно).

П р и м е р 1. У практически здоровой женщины 48 лет берут 0,02 мл крови из пальца и помещают в 1,0 мл дистиллированной воды с добавлением 5%-ного раствора лимоннокислого натрия в соотношении 6:1 (рН 7,6). Через 30-40 мин определяют показатель активности каталазы (ПАК) гемолизата модифицированным методом измерения ее активности по высоте столба пены, образующейся при реакции с перекисью водорода (Gross Von J. et al. 1975). Высота столба пены составляет 34 мм. Затем пробу центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин и определяют ПАК надосадочной жидкости, который составляет 26 мм. Разность полученных показателей 8 мм, т.е. 23,5% от общей активности гемолизата представлено мембраносвязанной каталазой.

П р и м е р 2. У больной 40 лет с диагнозом рак желудка III ст. вышеописанным методом берут и исследуют кровь. ПАК гемолизата 23 мм, ПАК надосадочной жидкости 21 мм. Разность полученных показателей составила 2 мм, т. е. на долю мембраносвязанной каталазы приходится 8,7% Таким образом, преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известным являются: повышение точности за счет оценки всего объема мембраносвязанной каталазы, а не только той ее части, которая прочно связана со стромой; снижение трудоемкости исследования образец крови, кроме однократного центрифугирования не подвергается никаким дополнительным воздействиям; быстрота выполнения исследования от момента забора крови до получения результата проходит 1-1,5 ч.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ КАТАЛАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ, включающий изучение активности фермента, отличающийся тем, что измеряют общую активность каталазы гемолизата, затем гемолизат центрифугируют с последующим определением активности каталазы супернатанта и расчетом уровня мембраносвязанной катализы путем вычисления разности первого и второго показателей активности фермента, при этом полученную разность выражают в процентах от общей активности каталазы.