Способ выделения гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека

 

Использование: изобретение относится к области биотехнологии и касается получения рекомбинантного инсулина человека, конкретно к усовершенствованному способу выделения гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека. Сущность: способ заключается в отделении гибридного белка в виде тел включения после дезинтеграции клеток от растворимых примесей микрофильтрацией с последующей диафильтрацией до концентрации белка 0,4-0,45 мг/мл при pН 6,0-6,3; растворении тел включения и отделении гибридного белка микрофильтрацией с последующей диафильтрацией 6-8 объемами буфера по отношению к объему микрофильтрата до концентрации белка 0,35-0,4 мг/мл и сопряженной с ними ультрафильтрацией; очистке осаждением примесных белков при pН 5,4-5,6 или посредством 5-ти кратного разбавления водой с последующим удалением примесей и обессоливанием путем микрофильтрации и ультрафильтрации и сопряженной с ними диафильтрации, которую проводят 10-тью объемами буфера по отношению к объему микрофильтрата при pН 7-8 с дальнейшей лиофилизацией или посредством добавления равного объема 96% этилового спирта с последующим центрифугированием, упариванием и лиофилизацией супернатанта. Способ прост, технологичен, эффективен и экономичен и может быть использован для различных видов гибридных белков. 2 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения рекомбинантного инсулина человека, который может быть применен в качестве лекарственного средства с антидиабетическим действием, конкретно к усовершенствованному способу выделения гибридного белка, содержащего последовательность проинсулина человека.

Инсулин гормон поджелудочной железы, регулирующий процессы углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара в крови. Инсулин синтезируется на рибосомах в виде одноцепочечного предшественника препроинсулина, из которого генерируется проинсулин, который в свою очередь продуцирует инсулин. Ввиду того, что инсулин животного происхождения не может удовлетворить потребность в этом гормоне, а также ввиду высокой видовой специфичности, в медицине имеется необходимость в синтетическом инсулине с первичной структурой, соответствующей структуре инсулина человека. В настоящее время разработана технология биосинтеза гибридного белка (ГБ), включающего последовательность проинсулина человека, с помощью рекомбинантных микроорганизмов, несущих ген этого белка [1] Известен способ выделения гибридного белка из клеток рекомбинантных микроорганизмов (2), который заключается в том, что клетки дезинтегрируют, отделяют гибридный белок в виде тел включения от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тела включения в буфере, содержащем 7,5 М мочевину, 0,2 М NaCl и другие ингредиенты в течение 20 часов, отделяют растворившийся гибридный белок от нерастворившихся примесей при помощи центрифугирования, проводят микрофильтрацию супернатанта на фильтрационной установке типа "Минитан" через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, для уменьшения ионной силы микрофильтрат разводят в 4 раза дистиллированной водой и проводят хроматографическую очистку рекомбинантного белка на колонке с сорбентом ДЕАЕ-Сефароза FF (Фармация, Швеция) в градиенте концентраций NaCl в течение 4-х часов. Полученный элюат содержит 15 г рекомбинантного белка. Фракции анализируют методом электрофореза в полиариламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях с последующим сканированием и интегрированием площадей пиков соответствующих белковых полос. Объединяют фракции с содержанием гибридного белка не ниже 60% Далее проводят обессоливание раствора гибридного белка при помощи гельхроматографии на колонке с сорбентом Сефадекс G-25 (Фармация, Швеция) в летучем буфере. На выходе с колонки собирают отдельные фракции элюата, содержащие в общей сложности 12 г белка и лиофильно высушивают полученный раствор. Выход лиофильно высушенного гибридного белка составляет 12 г.

Поскольку в способе-прототипе отсутствуют конкретные данные о выходах по стадиям и конечном выходе гибридного белка приводим для сравнения с заявляемым способом пример получения гибридного белка, осуществленный авторами по способу-прототипу. Авторы показали, что выход гибридного белка по способу-прототипу составляет 40% (см. пример 5).

Недостатки известного способа: низкий выход целевого продукта, сопряженный с большими потерями при проведении двухступенчатой хроматографической очистки; сложность процесса, обусловленная необходимостью хроматографического разделения соединений, требующего больших количеств сорбента, сложного и дорогостоящего лабораторного и производственного оборудования.

Целью предполагаемого изобретения является повышение выхода гибридного белка и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается заявляемой комбинацией стадий выделения гибридного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, и оптимизацией условий выделения гибридного белка.

Способ заключается в следующем: клетки рекомбинантных микроорганизмов дезинтегрируют, гибридный белок в виде тел включения отделяют от водорастворимых примесей путем микрофильтрации до концентрации белка 0,4-0,45 мг/мл при pН 6,0-6,3, затем тела включения, содержащие гибридный белок, растворяют в буфере, содержащем 7,5 М мочевину, 0,2 М NaCl и другие ингредиенты и проводят микрофильтрацию, при которой в режиме диафильтрации гибридный белок вымывается из микроконцентрата. Этот процесс сопряжен с процессом ультрафильтрации, при котором гибридный белок концентрируется, а раствор мочевины после прохождения через ультрафильтрационные мембраны используют для диафильтрации гибридного белка на микрофильтрационной установке. Следующим этапом выделения является осаждение примесных белков и других компонентов раствора. К полученному после концентрирования раствору добавляют равный объем 96% этилового спирта с дальнейшим центрифугированием, упариванием и лиофилизацией супернатанта или проводят осаждение гибридного белка посредством 5-ти кратного разбавления водой с последующим удалением примесей и обессоливанием путем микрофильтрации, ультрафильтрации и сопряженной с ними диафильтрации, которую проводят 10 объемами буфера по отношению к объему микрофильтрата при pН 7-8 с дальнейшей лиофилизацией (фиг. 1 и фиг. 2).

Подобная комбинация стадий, проведенных в описанных условиях, в литературе не обнаружена.

В предлагаемом способе использованы простые и технологичные методы выделения, такие как осаждение белков, микро- и ультрафильтрация белковых растворов, заменяющие сложные и дорогостоящие хроматографические процессы.

Замена хроматографической очистки на этапе выделения ГБ обусловлена также тем, что в молекуле гибридного белка имеется шесть цистеиновых аминокислотных остатков, которые при проведении процесса выделения образуют как внутримолекулярыне, так и межмолекулярные дисульфидные связи. В результате гибридный белок существует в виде множества молекулярных изоформ и не может элюироваться при проведении хроматографического процесса в виде одного пика. Поэтому при элюировании выбирают область, в которой находится максимальное количество гибридного белка, а это связано с потерей качества продукта или уменьшением его выхода. Например, при проведении ионообменой хроматографии на колонке с сорбентом ДЕАЕ-Сефароза FF в известном способе более 25% ГБ не задерживается на сорбенте, основная часть гибридного белка элюируется в широком интервале концентраций NaCl, от 30 мМ до 0,25 М. Некоторая часть гибридного белка, более 5% элюируется при высоких концентрациях NaCl, вплоть до 1 М. При применении эксклюзионной хроматографии мономерная форма будет элюироваться практически в виде одного пика, однако наличие в растворе олигомерных форм ГБ приводит к неэффективности использования этой хроматографии. Приведение гибридного белка к одной форме, например посредством реакции сульфитолиза, позволяет при проведении хроматографических процессов элюировать его в виде одного пика.

На стадии очистки для осаждения примесных белков к концентрированному раствору гибридного белка добавляют равный объем 96% этилового спирта и полученную смесь оставляют при температуре 4^oC на 17 часов для формирования осадка. Более простым и дешевым является осаждение примесных белков разведением раствора гибридного белка в 5 раз дистиллированной водой с доведением pН раствора до 5,5 уксусной кислотой. При этом в растворе сразу формируется осадок, который кроме белковых примесей содержит большое количество примесей (около 75%) по массе, не определяемых с помощью электрофореза в ПААГ. Вместе с осадком соосаждается незначительная часть ГБ, около 15% Содержание гибридного белка в растворе после осаждения примесей составляет 65-75% по данным электрофореза в ПААГ и не уступает таковому при получении ГБ с использованием хроматографической очистки.

В случае необходимости получения препарата гибридного белка с более высоким содержанием основного вещества к раствору, полученному после осаждения, добавляют 2 объема ацетона. Смесь выдерживают при температуре 4^oC в течение 17 часов. При этом формируется осадок с 70-85% содержанием гибридного белка по данным электрофореза в ПААГ. Полученный в виде осадка гибридный белок может быть высушен лиофилизацией или атмосферной сушкой. Получение ГБ в виде осадка удешевляет промышленное производство этого препарата, так как позволяет лиофилизировать много раз меньшие объемы или заменить этот дорогостоящий процесс на атмосферную сушку. Препарат, полученный таким образом, может храниться при температуре 18^oC не менее 60 дней.

В случае необходимости получения препарата с содержанием ГБ 90-95% предлагается привести ГБ к одной форме посредством реакции сульфитолиза, затем провести анионообменую хроматографию в градиенте концентраций NaCl, при этом сульфонат ГБ элюируется в виде одного пика. Далее его осаждают доведением pН раствора до 4,5, отмывают осадок и подвергают лиофилизации или атмосферной сушке. В отличие от описанного выше, в данном случае выход ГБ ниже, так как введена дополнительная стадия реакция сульфитолиза, которая протекает с выходом 80-90% выход гибридного белка при проведении ионообменной хроматографии составляет также около 80-90% таким образом суммарный выход составляет 72% Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: после дезинтеграции клеток рекомбинантных микроорганизмов гибридный белок в виде тел включения отделяют от растворимых примесей путем микрофильтрации, которая позволяет отмыть тела включения водным буфером в режиме диафильтрации при pН 6,0-6,3 до концентрации белка в микрофильтрате 0,4-0,45 мг/мл. После растворения тел включения в буфере, содержащем мочевину, на стадии отделения гибридного белка от нерастворимых примесей проводят сопряженный процесс микро- и ультрафильтрации. При этом, в процессе микрофильтрации раствора гибридного белка в режиме диафильтрации 6-8 объемами буфера по отношению к объему микроконцентрата гибридный белок вымывается из микроконцентрата до концентрации белка 0,35-0,40 мг/мл.

Этот процесс сопряжен с ультрафильтрацией, при которой гибридный белок концентрируют, а раствор мочевины после прохождения через ультрафильтрационные мембраны используют для диафильтрации раствора гибридного белка на микрофильтрационной установке. Эта комбинация двух процессов в единую процедуру позволяет без дополнительных затрат на приготовление буфера для pастворения тел включения максимально полно извлечь гибридный белок при промывке концентрата, а по окончании процедуры оставшийся раствор мочевины использовать для растворения тел включения следующей партии.

Очистку проводят путем осаждения примесных белков при pН 5,4-5,6 или посредством 5-ти кратного разбавления водой с последующим удалением примесей и обессоливанием микрофильтрацией, ультрафильтрацией и сопряженной с ними диафильтрацией, которую проводят при pН 7-8 и 10-тью объемами буфера по отношению к объему ультрафильтрата с дальнейшей лиофилизацией или посредством добавления равного объема 96% этилового спирта с последующим центрифугированием, упариванием и лиофилизацией супернатанта.

Таким образом, предлагаемый способ выделения гибридного белка позволяет значительно повысить (до 84%) выход целевого продукта. Способ технологичен, прост, эффективен, экономичен дает возможность отказаться от сложного и дорогостоящего оборудования и сорбентов.

Способ может быть использован для всех видов биосинтетически полученного гибридного белка.

Для лучшего понимания сущности предполагаемого изобретения ниже приводятся конкретные примеры его осуществления.

Пример 1. Осажденные клетки E.coli штамма JM-109 с суммарным содержанием белка, определяемым по реакции Лоури, около 800 г и с содержанием гибридного белка, определяемым при помощи электрофореза в ПААГ, около 200 г разрушают при помощи проточного дезинтегратора. Полученную суспензию подвергают микрофильтрации с последующей диафильтрацией для отмывки тел включения от водорастворимых примесей до концентрации белка в микрофильтрате 0,4 мг/мл. Для этого по достижении объема микроконцентрата 10 л через установку пропускают 100 мл 30 мМ ацетатного буфера с pН 6,0, содержащего 0,1 М aCl. Далее производят растворение тел включения в течение 15 часов при перемешивании в растворе объемом 60 л, содержащем 30 мМ трис-HCl, рН 7,5; мочевину 7,5 М; 0,2 М NaCl; 0,01 М дитиотреитол; 0,01 М трилон Б. Затем проводят процесс микрофильтрации раствора гибридного белка, сопряженный с процессом ультрафильтрации, при котором гибридный белок концентрируется, а ультрафильтрат, который не содержит гибридного белка, поступает на отмывку микроконцентрата от гибридного белка. Отмывку проводят 8-ю объемами буфера по отношению к объему микроконцентрата и заканчивают при содержании белка в микрофильтрате, равном 0,35 мг/мл. Конечный объем ультраконцентрата составляет 10 л. Этот раствор разводят дистиллированной водой в 5 раз и доводят pН раствора до 5,5±0,25% уксусной кислотой. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием или микрофильтрацией. Полученный раствор концентрируют на ультрафильтрационной установке до объема 10 л и диафильтруют, для чего через установку пропускают 100 мл 30 мМ ацетат аммонийного буфера, pН 8,07. Полученный раствор лиофилизуют.

Общее содержание белка в полученном препарате составляет 240 г, содержание гибридного белка составляет 168 г или 70% соответственно выход гибридного белка составляет 84% Пример 2. Осажденные клетки E.coli штамма JM-109 с общим содержанием белка около 800 г и содержанием гибридного белка около 200 г дезинтегрируют, отмывают тела включения, растворяют тела включения и извлекают гибридный белок из полученного раствора аналогично описанному в примере 1. В полученный ультраконцентрат приливают равный объем 96% этилового спирта. Полученную смесь оставляют при температуре 4^oC на 17 часов. По окончании инкубирования раствора примесные белки осаждают центрифугированием (3 тыс. об/мин, 15 мин). Супернатант упаривают и подвергают лиофилизации. Общее содержание белка в полученном препарате составляет 240 г, содержание гибридного белка составляет 168 г или 70% соответственно выход гибридного белка составляет 84% Пример 3. Осажденные клетки E.coli штамма JM-109 с общим содержанием белка около 800 г и с содержанием гибридного белка около 200 г дезинтегрируют, отмывают тела включения, растворяют тела включения, извлекают гибридный белок из полученного раствора и осаждают примеси аналогично примеру 2. Далее к супернатанту приливают 2 объема ацетона. Полученную смесь выдерживают при температуре 4^oC в течение 17 часов. По окончании инкубирования осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием (3 тыс. об/мин, 15 мин). Полученный осадок подвергают лиофилизации или атмосферной сушке. Общее количество белка в полученном препарате составляет 188 г, содержание гибридного белка составляет 150 г или 80% соответственно выход гибридного белка составляет 75% Пример 4. Осажденные клетки E.coli штамма JM-109 с общим содержанием белка около 800 г и с содержанием гибридного белка около 200 г дезинтегрируют, отмывают тела включения, растворяют тела включения, извлекают гибридный белок из полученного раствора, осаждают примеси и концентрируют раствор ГБ аналогично описанному в примере 1. Полученный раствор ГБ подвергают реакции сульфитолиза, для чего добавляют мочевину до концентрации 7,5 М; сульфит натрия до концентрации 0,2 М; 100 г тетратионата натрия, доводят pН до 9,0 при помощи 1 М NaCl и оставляют раствор перемешиваться на 15 часов. Далее раствор разводят в 5 раз дистиллированной водой и проводят хроматографическую очистку на колонке с сорбентом ДЕАЕ-Сефароза ГГ в градиенте концентраций NaCl. Раствор наносят на колонку объемом 5 литров (112 см х 50 см), уравновешенную 30 мМ трис-НСl буфером pН 7,5 со скоростью 5 л/час. После нанесения раствора колонку отмывают от несорбированных примесей уравновешивающим буфером. Затем белок элюируют в режиме линейного градиента NaCl от 0 до 1 М в течение 8 часов со скоростью 5 л/ч. При этом сульфонат гибридного белка элюируется в виде одного пика, его осаждают доведением pН раствора до 4,5. Осадок отделяют центрифугированием (3 тыс.об/мин. 15 мин). Осадок промывают и подвергают лиофилизации или атмосферной сушке. Общее количество белка в полученном препарате составляет 125 г, содержание гибридного белка составляет 115 г или 90-95% соответственно выход целевого продукта составляет около 57% Пример 5. Пример по способу-прототипу. Осаждают клетки E.coli штамма JM-109 с суммарным содержанием белка 400 г, определяемым по реакции Лоури, и содержанием гибридного белка 100 г, определяемым при помощи электрофореза в ПААГ, дезинтегрируют. Полученную суспензию подвергают центрифугированию (125 тыс. об/мин, 1 час) для отделения гибридного белка в виде тел включения, осадок растворяют в течение 20 часов в 24 л 30 мМ трис-HCl буфера, pН 7,5, содержащего 7,5 М мочевину, 0,2 NaCl, 0,01 М дитиотреитол и 0,01 М трилон Б. Нерастворившиеся частицы удаляют из раствора центрифугированием (8 тыс. об/мин. 1 час) и супернатант подвергают микрофильтрации через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм. Содержание гибридного белка в полученном растворе составляет 70 г, что соответствует 70% от содержания ГБ в исходном материале. Затем гибридный белок подвергают хроматографической очистке, для чего раствор разбавляют дистиллированной водой в 4 раза и наносят со скоростью 9 л/час на колонку (14,5 см х 40 см), заполненную сорбентом ДЕАЕ-Сефароза FF, предварительно уравновешенную 30 мМ трис-НCl буфером, pН 7,5. После нанесения раствора и отмывки несорбируемых примесей уравновешивающим буфером осуществляют элюирование гибридного белка в градиенте концентраций от 0 до 0,25 М NaCl в 30 мМ трис-HCl буфере pН 7,5. Содержание гибридного белка в элюате составляет 42 г. Затем проводят обессоливание раствора гибридного белка на колонке (21 см х 90 см), заполненной Сефадексом G-25 со скоростью 15 л/час, в качестве элюента используют 50 мМ раствор бикарбоната аммония, pН 8,0. Количество гибридного белка в элюате составляет 40 г. После лиофилизации содержание гибридного белка в полученном препарате составляет 40 г, что соответствует выходу 40% по отношению к гибридному белку в исходном материале.

Формула изобретения

Способ выделения гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека, из клеток рекомбинантных микроорганизмов, включающий дезинтеграцию клеток, отделение гибридного белка в виде тел включения от водорастворимых примесей, растворение тел включения в буфере, содержащем мочевину, отделение раствора гибридного белка от нерастворимых примесей, очистку, обессоливание и лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода гибридного белка, гибридный белок в виде тел включения отделяют от растворимых примесей путем микрофильтрации с последующей диафильтрацией до концентрации белка 0,4 0,45 мг/мл при pН 6,0 - 6,3, после растворения тел включения раствор гибридного белка подвергают микрофильтрации с последующей диафильтрацией 6-8 объемами буфера по отношению к объему микроконцентрата до концентрации белка 0,35 0,4 мг/мл и сопряженной с ними ультрафильтрации, очистку и обессоливание проводят путем осаждения примесных белков при pН 5,4 5,6 или посредством пятикратного разбавления водой с последующими процессами микрофильтрации, ультрафильтрации и сопряженной с ними диафильтрации, которую проводят 10 объемами буфера по отношению к объему микрофильтрата при pН 7 8, с дальнейшей лиофилизацией или посредством добавления равного объема 96%-ного этилового спирта с последующим центрифугированием, упариванием и лиофилизацией супернатанта.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2